N2神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）免疫可在缺乏交叉NA抑制抗体的情况下保护小鼠抵御异源甲型流感病毒攻击

《mSphere》：Immunization with N2 neuraminidase can protect mice against a heterologous influenza A virus challenge even in the absence of cross-NA inhibiting antibodies

　　

神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）抑制（Neuraminidase inhibition, NAI）滴度已被确定为预防流感的独立保护性相关指标。然而，很少有研究探讨基于NA的免疫保护的广度。此前，研究人员已报道2009年至2017年间流行的人H3N2病毒来源的N2 NA可分为四个抗原组（Antigenic groups, AGs）。在此，研究人员（i）用代表这四个抗原组的H3N2毒株重组可溶性四聚体NA免疫小鼠，或（ii）将N2 NA免疫血清被动转移至 naive 小鼠，以评估对异源HxN2流感病毒攻击的保护广度。研究表明，保护广度超越NAI广度，且与交叉反应性抗体的存在相关。有趣的是，在缺乏交叉反应性抗体时，用异源重组N2 NA（源自A/Perth/16/2019）免疫DBA/2J小鼠，会导致其在受到携带A/Indiana/08/2011（H3N2）NA的HxN2病毒或H2N2 A/Singapore/1/1957攻击时疾病早期发作。这种早期疾病发作是单向性的，在用携带A/Perth/16/2009（H3N2）NA的HxN2病毒攻击已用A/Indiana/08/2011重组NA免疫的小鼠时并未观察到该现象。

## 研究背景与问题

流感病毒表面的两种主要糖蛋白——血凝素（Hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）在病毒复制周期中发挥互补作用。HA结合唾液酸是病毒入侵的关键步骤，而NA则切割末端唾液酸残基，这种平衡活动使流感病毒能够穿透呼吸道黏膜屏障并释放子代病毒颗粒。尽管传统流感疫苗主要靶向HA，但自20世纪70年代起，研究就已指出NA作为免疫原的保护效应，近期研究进一步证实抗NA抗体是预防流感的独立保护性相关指标。然而，NA在常规裂解灭活疫苗中的免疫原性欠佳，且重组HA疫苗中完全缺失NA。此外，虽然单克隆抗体可通过封闭催化位点抑制NA活性，但非抑制性NA特异性抗体仍可凭借Fc效应功能保护小鼠，且基于NA的免疫保护广度尚不清楚。

此前，研究人员通过基于胎球蛋白（fetuin）的NAI测定，确定了2009至2017年间人H3N2病毒NA的抗原多样性，揭示了四个主要NA抗原组（AG1-AG4）。本研究旨在利用这些代表性毒株，系统评估主动免疫与被动转移条件下，N2 NA特异性免疫保护的广度及其与交叉反应性抗体的关系。

## 关键技术方法

研究采用AF03佐剂化的重组四聚体NA（tetNA）蛋白作为免疫原，在DBA/2J小鼠模型中进行免疫-攻击实验。血清学分析包括镍包被板捕获ELISA测定抗tetNA IgG终点滴度，以及基于胎球蛋白的酶联凝集素测定（Enzyme-Linked Lectin Assay, ELLA）测定NAI滴度。为规避近期人H3N2病毒在小鼠中致病性差的局限，研究人员构建了携带A/mallard/Sweden/81/2002（H6N1）来源HA、PR8内部基因片段及选定人H3N2病毒N2 NA的HxN2重组病毒作为攻击毒株。被动保护实验采用免疫血清腹腔转移（100 μL/ 只小鼠，攻击前1天）至naive DBA/2J小鼠。H2N2 A/Singapore/1/1957病毒经10代小鼠肺和MDCK细胞传代适应以增强毒力。统计学分析采用残差最大似然法（REML）分析体重变化，Mantel-Cox（log-rank）检验比较生存率。

## 研究结果

**HxN2毒株在DBA/2J小鼠中的致病性**

研究人员首先评估了五种代表四个抗原组的N2 NA免疫原：Per09（AG1）、Tex12（AG1）、Sin16（AG2）、Hel823（AG3）和Ind11（AG4）。通过在中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）细胞中表达制备可溶性四聚体重组NA蛋白。初始以BALB/c小鼠建立HxN2攻击模型失败，该品系即使接种最高剂量（8.2 × 10³ PFU/只）HxN2Per09仍无疾病征象。转而使用DBA/2J小鼠后，除HxN2Sin16外，所有HxN2重组病毒均表现出致病性，半数致死剂量（LD₅₀）通过Reed-Muench法计算确定。

**不同抗原组NA免疫对HxN2Per09的保护作用**

研究人员以Per09、Tex12、Sin16、Hel823和Ind11 N2分别免疫DBA/2J小鼠（0.1 μg AF03佐剂，间隔2周加强），2周后采血并攻击5 LD₅₀ HxN2Per09。ELISA结果显示，同源Per09 N2免疫诱导最高血清IgG滴度，同属于AG1的Tex12 N2亦诱导高滴度；Sin16 N2（AG2）免疫组有较高交叉反应性IgG，但显著低于同源组；Hel823 N2（AG3）和Ind11 N2（AG4）免疫组交叉反应性抗体滴度显著较低。NAI测定显示，仅Per09 N2和Tex12 N2免疫血清对HxN2Per09有显著抑制活性，其余抗原组免疫血清NAI滴度低或检测不到。然而，尽管Sin16、Hel823和Ind11 N2免疫组缺乏交叉NAI抗体，所有tetNA免疫组均完全抵御HxN2Per09攻击，仅PBS对照组出现体重下降和死亡。同源NAI测定证实了各免疫组的成功致敏。

**Per09 N2免疫对携带不同抗原组NA的HxN2病毒的保护作用**

研究人员进一步评估Per09 N2免疫对异源HxN2攻击的交叉保护。针对AG1的Tex12：Per09与Tex12呈现双向交叉反应性，ELISA和NAI均证实这一点，两组均完全保护抵御5 LD₅₀ HxN2Tex12攻击。针对AG2的Kan17（因HxN2Sin16无致病性而选用同组Kan17）：Per09和Sin16 N2免疫均诱导可检测的交叉反应性IgG，Per09免疫组虽NAI滴度低于Sin16组但仍可检测到，两组同等保护抵御5 LD₅₀ Hx通过对这些内容的分析，看：模型攻击。针对AG3的Hel823：Per09 N2免疫诱导与Hel823 N2免疫相当水平的Hel823交叉反应性IgG，但完全缺乏交叉NAI活性；尽管如此，Per09 N2免疫组攻击后仅出现短暂体重下降，与同源Hel823 N2免疫组保护效果相当，表明非抑制性交叉反应抗体可贡献于异源NA攻击保护。针对AG4的Ind11：Per09 N2免疫诱导极低或不可检测的Ind11交叉反应性ELISA滴度，NAI亦大多缺失；仅Ind11 N2同源免疫组抵御5 LD₅₀ HxN2Ind11的死亡和发病，而Per09 N2异源免疫组出现疾病早期发作。降低攻击剂量至2 LD₅₀进一步证实该现象。

**N2免疫血清介导的被动保护**

为验证保护是否由抗体介导，研究人员将Per09、Sin16、Hel823和Ind11 N2免疫血清（1 μg免疫剂量，加强后2周采血、 Pool）被动转移至naive小鼠，攻击2 LD₅₀各HxN2病毒。Per09攻击结果显示：Per09、Sin16和Hel823 N2免疫血清均可保护，仅Ind11 N2免疫血清不能；所有转移血清均有可检测Per09交叉反应性IgG，但仅Per09和Sin16血清有交叉NAI活性。Kan17攻击结果显示：所有四种N2免疫血清均保护体重下降，生存曲线无差异；虽均有Sin16交叉反应抗体，仅Ind11免疫血清缺乏Kan17 NAI活性。Hel823攻击结果显示：所有免疫血清均保护；虽均有Hel823交叉反应抗体，仅同源血清有NAI活性。Ind11攻击结果显示：仅同源Ind11和部分交叉的Hel823 N2免疫血清减轻体重下降；Per09和Sin16血清Ind11反应性接近检测限且NAI缺失。值得注意的是，Per09 N2免疫小鼠观察到的Ind11攻击早期疾病发作在被动trained to avoid such content.血清转移中未重现，提示单纯异源抗体不足以或并不贡献于该模型中的疾病增强。

**Per09 N2免疫对H2N2 Sin57攻击无保护作用**

基于1968年H3N2大流行期间先前H2N2暴露所诱导的NA特异性免疫减轻疾病严重度的证据，研究人员评估Per09 N2免疫对小鼠适应化A/Singapore/1/1957（H2N2）攻击的保护。原始Sin57在DBA/2J小鼠中致病性差（LD₅₀ = 1.8 × 10⁵ PFU/只），经10代适应获得小鼠适应株（LD₅₀ = 4.6 × 10² PFU/只），携带HA的G103S/K422R及NA的G111D替换。5 LD₅₀攻击实验显示，同源Sin57 N2免疫组全部存活，而Per09 N2异源免疫组未获保护且出现早期发病死亡趋势。降低至0.5 LD₅₀攻击证实：同源组和PBS组仅轻微短暂体重下降，而Per09 N2免疫组发病率和死亡率增加。Sin57与Per09之间无交叉NAI抗体，且大多数Per09免疫小鼠缺乏Sin57交叉反应性ELISA滴度。

## 讨论与结论

本研究证实，尽管NAI滴度是独立的保护性相关指标，NA尚未被纳入标准化流感疫苗组分，部分原因在于其不稳定性及对NA抗原性认知的局限。研究人员利用此前定义的四个H3N2 NA抗原组代表毒株，通过AF03佐剂化N2 NA主动免疫小鼠，证明在缺乏NA抑制抗体的情况下仍可实现对HxN2病毒攻击的保护。

建立HxN2攻击模型时，研究人员选用携带H6 HA（源自A/mallard/Sweden/81/2002）和PR8内部基因的重组病毒，成功在DBA/2J小鼠中建立了除HxN2Sin16外均有效的致病模型。Sin16和Kan17所属AG2的NA具有更高K_m值，可能导致H6与N2功能平衡欠佳。

主动免疫实验中，尽管Sin16、Hel823和Ind11 N2免疫缺乏针对HxN2Per09的交叉NAI活性，但均完全保护Per09攻击，且诱导了针对不同亚群的瞩目现象：Per09 N2免疫小鼠在受到HxN2Ind11或H2N2 Sin57攻击时出现疾病早期发作，但该现象未在血清转移实验中重现，提示可能存在细胞免疫机制参与。这种早期疾病并非普遍现象，仅限于HxN2Ind11和H2N2 A/Singapore/1/1957攻击条件。序列比较显示Ind11与Sin57相对于Per09的高度变异，特别是邻近催化口袋的替换，解释了交叉反应性缺失与保护失败。

研究人员指出，部分检测到的交叉反应抗体可能靶向四分支结构域（tetrabrachion domain），该拉链结构具有免疫原性但非免疫显性，在捕获ELISA中可能较难及。

总体而言，研究数据支持N2 NA特异性抗体介导的异源保护不依赖于交叉抑制抗体，而依赖于交叉反应性抗体。多项临床研究已确认NAI作为独立保护性相关指标的价值，但鲜有研究关注NA结合抗体的预测价值。基于小鼠数据，研究人员假设NA结合滴度预测的保护广度可能优于NAI滴度，这进一步鼓励将NA作为标准化疫苗抗原以改善流感预防。该论文发表于《mSphere》。