《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：ScRNA-seq analysis reveals the effects of nitrite stress on the endocrine system of the eyestalk in Litopenaeus vannamei
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李云鳌|马凌淼|钟文军|宋冰雪|李文娟|李云|戴希林|傅远帅中国上海市201306，上海海洋大学，农业农村部淡水水产遗传资源实验室摘要亚硝酸盐是南美白对虾养殖过程中产生的有害物质，主要源于过量饲料和虾粪未能充分分解。其在水中的积累会影响虾的生长和生理功能，损害免疫系统，甚至导致大
李云鳌|马凌淼|钟文军|宋冰雪|李文娟|李云|戴希林|傅远帅
中国上海市201306，上海海洋大学，农业农村部淡水水产遗传资源实验室
摘要
亚硝酸盐是南美白对虾养殖过程中产生的有害物质，主要源于过量饲料和虾粪未能充分分解。其在水中的积累会影响虾的生长和生理功能，损害免疫系统，甚至导致大规模死亡，因此成为制约该产业绿色发展的关键环境因素。在亚硝酸盐胁迫下，作为甲壳类动物重要神经内分泌调控中心的眼柄通过调节能量代谢和免疫功能，参与机体的应激适应并发挥保护作用。然而，眼柄响应亚硝酸盐胁迫的分子调控机制尚不明确。本研究采用单细胞RNA测序技术分析南美白对虾眼柄细胞在亚硝酸盐胁迫下的异质性。共获得18,394个高质量细胞，鉴定出包括神经分泌细胞、运动神经元、感觉神经元、中间神经元、神经胶质细胞和支持细胞在内的6种主要细胞亚群。差异表达分析发现839个差异表达基因，不同细胞类型对亚硝酸盐胁迫表现出不同的特异性反应。功能富集分析表明，糖酵解、氧化磷酸化、核糖体功能以及内质网蛋白质加工等通路被显著激活，而信号转导和DNA修复相关通路则受到抑制。进一步分析显示，亚硝酸盐胁迫可引发线粒体功能变化并诱发氧化应激，从而影响眼柄的神经内分泌系统功能。本研究从单细胞层面揭示了眼柄对亚硝酸盐胁迫的转录组反应，为水产养殖环境管理提供了理论依据。
引言
亚硝酸盐是微生物硝化与反硝化过程中的中间产物，也是水产养殖中最常见的有害物质。在对虾养殖过程中，大量未被食用的饲料和排泄物会导致水体富营养化。当水中氧气不足或硝化细菌活性不够时，亚硝酸盐向硝酸盐的转化会被阻断，从而导致水中亚硝酸盐大量积累（Ciji和Akhtar，2020）。亚硝酸盐的积累不仅会恶化水质，还会抑制对虾的生长和蜕壳，增加其耗氧量和氨的排出量，甚至可能引发大规模死亡（Guo等人，2013）。作为全球最重要的养殖对虾品种，南美白对虾因其广盐性能够适应从海水到淡水的多种盐度环境（Li等人，2008）。然而在低盐度条件下，亚硝酸盐的毒性尤为突出（Sowers等人，2004）。亚硝酸盐引起的毒性会将血蓝蛋白中的Cu+氧化为Cu2+，进而降低血蓝蛋白的合成和携氧能力，导致组织缺氧（Li等人，2019）。在低盐胁迫下，对虾本来就需要通过上调Na+/K+-ATP酶等离子泵的活性来维持体内离子平衡（Huong等人，2010）；而亚硝酸盐的叠加效应会进一步消耗能量储备，加剧生理紊乱（Valencia-Casta?eda等人，2018）。有研究显示，在低盐条件下，南美白对虾对亚硝酸盐的96小时半数致死浓度约为5.25毫克/升，说明其对亚硝酸盐毒性的敏感性更高（Wang等人，2025）。研究表明，在急性亚硝酸盐胁迫下，南美白对虾体内的ATP含量显著下降，乳酸水平上升，这说明其能量供应被迫从有氧代谢转向效率较低的厌氧代谢途径（Li等人，2019）。长期处于这种代谢抑制状态会导致对虾生长迟缓、蜕壳周期紊乱以及存活率下降（Furtado等人，2016）。亚硝酸盐胁迫还会在斑节对虾中引发能量代谢紊乱、氧化损伤和内质网应激，进而导致细胞凋亡和自噬，降低存活率（Liu等人，2023）。在这一过程中，神经内分泌调控起着至关重要的作用，眼柄通过调节能量代谢和免疫功能帮助对虾抵抗亚硝酸盐胁迫（Li等人，2025）。
眼柄是甲壳类动物重要的神经内分泌调控中心，在生长发育、能量代谢和环境适应等方面发挥着核心调控作用。它通过释放甲壳类高血糖激素、抑蜕壳激素和抑性腺激素，调控包括繁殖、蜕壳、能量代谢和应激适应在内的多种重要生理过程（Kleinholz，1976；Sim?es等人，2024）。该器官通过分泌甲壳类高血糖激素来调节能量和碳水化合物代谢（Wang等人，2017），抑蜕壳激素通过抑制蜕壳类固醇的合成来调控蜕壳节奏（Lago-Lestón和Ponce，2007），而抑性腺激素则会对卵巢发育和卵黄生成起到抑制作用（Chen等人，2014b）。眼柄切除会影响肝胰腺的糖原代谢以及脂质、脂肪酸和蛋白质的储存（Sun等人，2014），这表明眼柄在能量分配和代谢调控中起着关键作用。因此，在亚硝酸盐胁迫条件下，眼柄可能通过调节与能量代谢相关的神经内分泌信号，维持渗透压稳态并减轻亚硝酸盐毒性。
尽管以往的研究已经从组织层面或整体转录组层面探讨了亚硝酸盐胁迫对对虾的影响，但针对内分泌系统层面的相关研究仍相对较少。单细胞RNA测序技术作为一种有效的方法，可用于分析细胞的异质性和功能状态。近年来，该技术已被广泛应用于多种水生无脊椎动物，包括日本沼虾、斑节对虾、香港青蟹和日本扇贝，极大提升了我们对细胞多样性的认识。本研究基于单细胞RNA测序技术，系统分析了南美白对虾在亚硝酸盐胁迫条件下的眼柄细胞，并构建了眼柄细胞图谱。此外，还揭示了不同细胞亚群在胁迫条件下的特异性转录反应，为深入理解对虾在亚硝酸盐胁迫下的细胞和分子适应机制提供了新的数据基础和理论依据。
章节摘录
对虾养殖与样本采集
健康状况良好的南美白对虾，体长为9±1.02厘米，体重为8±1.6克，先在水泥池中适应一周（水温25.0±1摄氏度，pH值8.0±0.2，溶解氧5.0±0.5毫克/升，盐度0.5‰，亚硝酸盐含量<0.05毫克/升），每天喂食三次商业饲料。之后将这些对虾转移到尺寸为1.5×1.5×1.0米的卤虫养殖池中进行实验。所选用的5毫克/升亚硝酸盐浓度是根据以往的毒性数据及初步暴露实验确定的
单细胞RNA测序识别眼柄细胞亚群
为分析南美白对虾眼柄在亚硝酸盐暴露后的细胞异质性，进行了单细胞转录组分析。共对18,394个细胞进行了测序（其中8238个属于S0.5组，10,156个属于S0.5-N组），这两个组的独特分子标识符平均数量分别为6343和9190，每个细胞对应的基因数量分别为1987和2052（见表S1）。细胞读取序列的深度在23,136到38,094之间，满足后续聚类的要求
亚硝酸盐胁迫对南美白对虾的影响
作为水产养殖系统中常见的环境胁迫因子，亚硝酸盐会对南美白对虾的健康造成严重威胁。其毒性机制较为复杂，涉及细胞层面的多种生理和生化过程。根据现有研究，亚硝酸盐胁迫首先会导致对虾体内亚硝酸盐积累。斑节对虾和罗氏沼虾体内的亚硝酸盐浓度分别上升了1.25倍和1.22倍（Chen和Chen，1992；Napolitano等人，2021）。同样，我们
CRediT作者贡献说明
李云鳌：论文撰写——初稿编写、可视化分析、验证、方法设计、研究实施、数据整理、概念构思。马凌淼：可视化分析、验证、研究实施、数据整理。钟文军：可视化分析、研究实施。宋冰雪：验证、数据整理。李文娟：方法设计。李云：方法设计。戴希林：项目监督、资源协调、项目管理、资金筹集。傅远帅：论文撰写——审阅与编辑、项目监督、资源协调、项目
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了上海现代农业产业技术体系的支持（项目编号：D-8004-22-0063）。
