《Immunobiology》：Neuropilin-1 serves as a prognostic marker and a potential target of M2-polarized tumor-associated macrophages in gastric cancer
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神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP1）近年来已成为一种具有前景的免疫检查点（immune checkpoint）。然而，其在胃癌（gastric cancer，GC）中的预后意义及其与肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvi
神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP1）近年来已成为一种具有前景的免疫检查点（immune checkpoint）。然而，其在胃癌（gastric cancer，GC）中的预后意义及其与肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）的关联仍缺乏充分认识。本研究中，对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据的分析显示，与正常对照相比，GC组织中NRP1表达升高。根据NRP1表达水平，将TCGA胃癌样本分为高表达组（n = 185）和低表达组（n = 185）。高表达组表现出更晚期的TNM分期和组织学分级，同时总体生存期显著缩短。两组间的差异表达分析提示，相关基因富集于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）相关信号通路及细胞趋化（cell chemotaxis）。值得注意的是，在TCGA队列中，NRP1表达与M2极化肿瘤相关巨噬细胞（M2-polarized tumor-associated macrophages，M2-TAMs）的浸润以及M2-TAMs标志物CD163的表达呈最强正相关。与此一致，NRP1高表达组的CD163表达更高。此外，对20例GC临床标本进行NRP1和CD163免疫组织化学分析并评分后发现，14例（70%）呈双阳性，3例（15%）呈双阴性。Pearson相关分析证实，NRP1染色强度与肿瘤分级及CD163评分均存在显著相关性。为探究因果关系，研究人员采用高或低NRP1表达GC细胞系的条件培养基处理THP-1单核细胞。来源于NRP1高表达细胞的上清液可促进THP-1细胞CD163表达和迁移，而这一效应可被NRP1抑制剂EG00229消除。综上，研究结果提示，NRP1可作为GC中的预后生物标志物（biomarker）和免疫调节分子，值得进一步研究，其作用机制可能与调控M2-TAMs的极化和募集有关。
该论文发表于《Immunobiology》，聚焦胃癌（gastric cancer，GC）中神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP1）的临床意义及其免疫调控作用，尤其强调其与M2极化肿瘤相关巨噬细胞（M2-polarized tumor-associated macrophages，M2-TAMs）的关系。研究背景在于，GC仍是全球癌症死亡的重要原因之一，尽管免疫治疗已改善部分晚期患者生存，但疗效常受限于高度免疫抑制性的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），即所谓“免疫冷”微环境。在这一背景下，M2-TAMs被认为是形成免疫抑制微环境的重要细胞成分，可通过分泌白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）、促进程序性死亡配体-1（PD-L1）与程序性死亡受体-1（PD-1）轴介导的T细胞耗竭，以及募集调节性T细胞（Tregs），抑制CD8
+ T细胞的抗肿瘤效应。因此，寻找既参与肿瘤进展又影响免疫微环境的关键分子，对GC精准治疗具有重要意义。NRP1作为多种细胞因子和膜受体的共受体，既参与肿瘤增殖、迁移、侵袭、抗凋亡及血管生成，也在多类免疫细胞上表达，但其在GC免疫调控中的作用尚未明确，因此开展本研究具有直接的理论和潜在转化价值。
研究人员首先基于TCGA数据库分析GC组织与癌旁组织的NRP1表达差异，并将患者按NRP1高低表达分组，比较其临床病理特征、总生存、差异表达基因及免疫抑制性细胞标志物。随后结合单细胞数据集GSE167297分析NRP1的细胞分布特征。临床部分纳入20例胃癌手术石蜡标本，进行NRP1与CD163免疫组织化学染色及相关性分析。功能实验方面，研究人员依据癌症细胞系百科全书（CCLE）筛选NRP1高表达与低表达GC细胞系，制备条件培养基处理THP-1单核细胞，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）评估M2相关标志物表达，并以Transwell迁移实验检测细胞募集能力，同时应用NRP1抑制剂EG00229进行干预。上述技术路线综合了公共队列分析、临床组织验证与体外功能实验，样本来源包括TCGA、TISCH中的GSE167297、CCLE以及20例临床胃癌组织。
在主要研究结果方面，论文按照多个小节逐步建立了NRP1与GC恶性进展及免疫抑制微环境的联系。
3.1. Elevated NRP1 expression was correlated with poor prognosis in gastric cancer
研究人员首先比较了GC组织与邻近非肿瘤组织中的NRP1表达，发现TCGA转录组数据显示NRP1在GC中显著上调。在此基础上，将患者划分为NRP1高表达组与低表达组后发现，NRP1高表达与更晚的TNM分期、更高的组织学分级相关，而且随着疾病进展，NRP1高表达病例所占比例增加。生存分析进一步显示，高NRP1表达患者总体生存期更短。该部分结果说明，NRP1不仅在GC中异常激活，而且与肿瘤侵袭性增强和不良预后密切相关，支持其作为预后标志物的潜力。
3.2. NRP1 expression was correlated with infiltration of immunosuppressive cells, particularly M2-polarized tumor-associated macrophages
为探究NRP1相关的生物学过程，研究人员对高低表达组之间的差异表达基因进行了分析。基因本体（Gene Ontology，GO）富集结果显示，上调基因主要集中于细胞外基质组织和细胞趋化等过程，提示NRP1可能参与肿瘤基质重塑和免疫细胞募集。进一步的免疫浸润分析发现，在多类肿瘤浸润免疫细胞中，NRP1与M2-TAMs丰度的正相关最强，其次为Tregs和中性粒细胞。与此同时，NRP1与M2-TAMs经典标志物CD163、CD206以及Tregs标志物CTLA4、FOXP3表达均呈正相关，其中与CD163的相关性最显著；这些免疫抑制标志物在NRP1高表达组中也明显升高。单细胞数据分析则显示，NRP1主要分布于内皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞以及单核/巨噬细胞。该部分表明，NRP1与GC中的免疫抑制性微环境构建密切相关，尤其与M2-TAMs浸润关系最为突出。
3.3. NRP1 immunohistochemical staining score was significantly positively correlated with CD163 score and tumor histological grade
在临床标本层面，研究人员对20例GC组织进行了NRP1与CD163免疫组织化学染色，并采用半定量评分法评估阳性比例。结果显示，14例为NRP1/CD163双阳性，3例为双阴性，提示二者具有明显一致性。进一步相关分析显示，NRP1免疫组化评分与CD163评分、肿瘤组织学分级均显著正相关，但与T分期或N分期无显著相关。该部分结果从组织病理层面验证了数据库分析的发现，即NRP1高表达往往伴随M2-TAMs标志物升高，并与较差分化程度相关，从而增强了研究结论的临床可信度。
3.4. NRP1 inhibition suppressed M2-TAM polarization and migration induced by gastric cancer cell conditioned medium
在机制与功能验证部分，研究人员利用CCLE筛选并经qRT-PCR确认AGS为相对NRP1高表达细胞系，SNU-1为相对低表达细胞系。随后收集两者条件培养基处理THP-1细胞。结果发现，SNU-1来源条件培养基对THP-1细胞中CD163、CD206和ARG1表达无明显影响，而AGS来源条件培养基可显著上调这些M2相关标志物表达，提示其促进巨噬细胞向M2表型极化。加入NRP1抑制剂EG00229后，这种上调效应呈剂量依赖性减弱。Transwell实验进一步显示，AGS条件培养基可增强THP-1细胞迁移，而EG00229同样可剂量依赖性逆转这一作用。附加的CCK-8实验排除了细胞增殖差异对迁移结果的干扰。该部分功能实验说明，高NRP1表达GC细胞可通过可溶性因子促进巨噬细胞募集和M2极化，而NRP1抑制能够阻断这一过程。
综合全文，讨论部分强调NRP1在GC中具有“双重功能”特征：一方面，其高表达与更高TNM分期、更高组织学分级及更差总体生存相关，提示其是反映肿瘤恶性生物学行为的重要预后因子；另一方面，其与M2-TAMs及其他免疫抑制性成分密切关联，并可通过肿瘤细胞来源的条件培养基在体外促进巨噬细胞M2极化和迁移，提示其参与塑造免疫抑制性TIME。研究还指出，NRP1抑制可能不仅直接限制肿瘤进展，还可能通过降低免疫抑制细胞丰度而改善免疫治疗敏感性。不过，论文同时明确提出若干局限性，包括介导M2调控的具体可溶性细胞因子尚未明确，NRP1与M2-TAMs极化/募集之间的机制联系仍需体内基因缺失实验验证，NRP1靶向增强免疫治疗效果尚待动物实验确认，以及临床样本量相对有限。因此，现阶段结论主要支持NRP1作为值得进一步研究的候选靶点，而非已经完成临床转化验证的成熟策略。
研究结论部分可译为：本研究确立了NRP1在GC中的双重作用属性，即其既是预后指示分子，也是通过调控M2-TAMs而参与免疫抑制性微环境塑造的调节分子。这些结果提示，该受体值得作为GC潜在治疗靶点开展进一步研究。
总体而言，该研究通过生物信息学分析、临床组织验证与体外功能实验相结合，较为系统地证明了NRP1在胃癌中的临床预后价值及其与M2-TAMs相关免疫抑制微环境之间的紧密联系，为后续围绕NRP1开展免疫治疗联合策略研究提供了依据。
