皮肤TRPV4(瞬时受体电位香草酸亚型4)增强电针刺激传入信号的传递

《ACS Omega》：Cutaneous TRPV4 Potentiates the Afferent Transmission of Electroacupuncture Stimulation

　　

电针刺激(electroacupuncture stimulation, ES)对多种疾病具有治疗作用，其主要机制为激活外周感觉神经。机械敏感离子通道瞬时受体电位香香草素亚型4(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)表达于外周非神经细胞，可能是ES的潜在分子感受器，但其在ES信号传递中的具体作用尚不清楚。本研究结合转基因小鼠体内钙成像(in vivo calcium imaging)与药物干预，探讨皮肤TRPV4如何在腰4背根神经节(lumbar 4 dorsal root ganglion, L4 DRG)水平调控传入信号。后肢足背2 mA ES比0.5 mA ES激活更多初级感觉神经元及TRPV1-Cre阳性伤害性感受器，并诱发更强的钙反应。免疫荧光显示TRPV4表达于皮肤巨噬细胞而非初级感觉神经元。为明确ES与TRPV4的机制联系，研究人员在局部激活或拮抗皮肤TRPV4后检测初级感觉神经元对ES的反应。皮内注射TRPV4激动剂GSK1016790A较 vehicle对照组增加出现自发钙瞬变(spontaneous calcium transients)的L4 DRG神经元数目——但不改变平均荧光强度——并使ES应答神经元比例呈升高趋势，同时显著增强钙瞬变强度；反之，TRPV4拮抗剂GSK2193874较 vehicle减少具有基础钙活性的神经元数量，并较激动剂组显著减弱ES诱发的钙反应。结果表明，皮肤中非神经元TRPV4增强ES过程中的传入信号传递，揭示了针感信号启动中被忽视的神经-免疫相互作用(neuroimmune interaction)作用，深化了对针刺如何在细胞水平引发传入信号的理解，并将皮肤TRPV4确立为调控ES诱发传入信号的潜在靶点。

论文解读：《Cutaneous TRPV4 Potentiates the Afferent Transmission of Electroacupuncture Stimulation》

该研究发表于《ACS Omega》。目前公认电针(electroacupuncture, EA/electroacupuncture stimulation, ES)通过激活穴位局部Aδ和C类纤维启动传入信号，经背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)传入中枢发挥调节作用，且TRPV1(transient receptor potential vanilloid 1)通道介导的C纤维激活已被证实参与EA抗炎及内脏调节效应。然而EA强度如何差异性地招募DRG神经元亚群，以及穴位局部非神经元细胞（特别是免疫细胞）上的机械敏感离子通道是否参与EA信号向感觉神经元的传递均尚未阐明。瞬时受体电位香草酸亚型4(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)是一种对机械力、低渗及>34°C温热敏感的阳离子通道，主要表达于内皮细胞、角质形成细胞及巨噬细胞等非神经元细胞而不表达于感觉神经元，是潜在的穴位机械刺激分子感受器。本研究假设较高强度ES优先招募特定DRG神经元群体，且皮肤非神经元TRPV4通过神经-免疫相互作用调控神经元兴奋性，采用Pirt-GCaMP6s、TRPV1-GCaMP6s及TRPV4-GCaMP6s转基因小鼠结合体内DRG钙成像及皮内TRPV4激动剂/拮抗剂干预，验证上述假设。

主要关键技术方法：

研究人员选用Pirt-GCaMP6s（全感觉神经元标记）、TRPV1-GCaMP6s（伤害性感受器标记）及他莫昔芬诱导型TRPV4-CreER::Rosa26-LSL-GCaMP6s（TRPV4表达细胞标记）转基因小鼠，麻醉下行右L4 DRG椎板切除术暴露DRG，使用共聚焦显微镜进行体内钙成像记录ΔF/F₀（激活阈值>30%），经后肢背侧足背给予不同强度（0.5 mA、2 mA，10 Hz）ES，或先于足背皮内注射TRPV4激动剂GSK1016790A（30 μM）、拮抗剂GSK2193874（30 μM）或vehicle（1% DMSO生理盐水）再行ES，同步记录基础及ES诱发钙活动；取皮肤及L4 DRG组织行免疫荧光双标（抗GFP/抗CD68或抗Nissl）；采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据分析小鼠表皮免疫细胞trpv4基因表达；数据进行Student's t检验、Mann–Whitney U检验或双因素ANOVA分析。

研究结果：

Different ES Intensities Elicit Distinct Activation Patterns in Primary Sensory Neurons（不同ES强度在初级感觉神经元中引发不同的激活模式）：

对Pirt-GCaMP6s小鼠后肢足背给予0.5 mA与2 mA ES并记录同侧L4 DRG钙活动，发现2 mA ES较0.5 mA同步诱发更强钙瞬变并激活更多初级感觉神经元，其中中、大直径神经元（分别对应于Aδ及Aβ纤维）响应增强尤为显著，表明2 mA ES更有效招募机械感受性Aδ/Aβ传入及可能由肌肉收缩间接激活的本体感觉Aβ纤维，小直径C纤维在两种强度间无显著差异。

TRPV4 Expression Was Detected in the Skin and DRG（在皮肤和DRG中检测到TRPV4表达）：

免疫荧光及TRPV4-GCaMP6s小鼠组织切片显示，TRPV4表达于皮肤CD68⁺巨噬细胞（亦见于内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞），但在L4 DRG神经元中无表达，确认TRPV4定位于皮肤驻留免疫细胞而非感觉神经元胞体或末梢，为其在穴位作为非神经元机械感受器提供解剖学依据。

The Response of Primary Sensory Neurons to ES Was Assessed Following the Local Activation or Antagonism of TRPV4 in the Skin（局部激活或拮抗皮肤TRPV4后评估初级感觉神经元对ES的反应）：

Pirt-GCaMP6s小鼠足背皮内注射TRPV4激动剂GSK101增加具自发钙瞬变的L4 DRG神经元数目（平均荧光强度不变），对2 mA ES产生更高比例（P=0.0692）应答神经元趋势并显著增强钙瞬变强度，该增强在大直径神经元中最明显；注射拮抗剂GSK219减少具基础钙活动的神经元数目（小直径神经元降低趋势P=0.0540），且较激动剂组显著降低2 mA ES诱发的应答神经元比例及钙瞬变强度（大直径神经元减弱明显），vehicle与GSK219组ES反应无显著差异。证明皮肤非神经元TRPV4紧张性调控感觉神经元兴奋性并可选择性促进ES诱发传入信号，该作用可能经免疫细胞源介质敏化邻近神经末梢实现。

The Activation of Nociceptive Neurons Was Compared across Different ES Intensities（比较不同ES强度下伤害性神经元的激活）：

TRPV1-GCaMP6s小鼠给予0.5 mA与2 mA ES，2 mA较0.5 mA激活显著更多的TRPV1⁺伤害性神经元并诱发更高钙荧光强度，与Pirt-GCaMP6s结果一致，表明ES强度差异影响伤害性传入传递，TRPV1介导信号需较高阈值，与既往 intensity依赖性EA效应相符。

Baseline Calcium Activity in Nociceptive Receptors Was Recorded after the Local Activation of TRPV4 Channels in the Skin, and Their Subsequent Response to ES Was Then Assessed（局部激活皮肤TRPV4通道后记录伤害性感受器基础钙活动并评估其对ES的反应）：

TRPV1-GCaMP6s小鼠足背先注射vehicle后注射GSK101，GSK101较vehicle显著增加L4 DRG神经元基础钙活动、提高ES（2 mA）应答神经元比例并增强钙瞬变强度，部分GSK101激活的神经元亦对ES有反应，直接证明皮肤细胞TRPV4激活敏化伤害性通路，提示其通过巨噬细胞源性因子（如IL-1β）间接调控TRPV1⁺传入。

总结与结论（翻译研究结论部分）：

本研究运用体内实时背根神经节钙成像阐明皮肤非神经元TRPV4通道如何通过神经-免疫相互作用调控ES传入信号。结果确立非神经元TRPV4是感觉信号调制中的关键介质，动态调节针刺刺激期间的神经元兴奋性。需注意本研究在生理基线条件下使用药理学工具操纵TRPV4活性，其发现向原生病理状态的转化相关性有待确立——生理状态下毫针致组织机械形变是直接激活皮肤TRPV4的 plausible刺激，而炎症状态下低渗应激及机械负荷增加可能进一步增强TRPV4激活放大神经-免疫信号及ES传入反应。这些发现为理解针刺外周作用机制提供了框架，并将皮肤TRPV4确立为开发靶向调控ES传入信号疗法的潜在新靶点，推进了对ES传入传递中神经-免疫相互作用的认识。