《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Effects of ethanol leaf extract of Spondias mombin on scopolamine-induced hippocampal neurodegeneration in adult male Wistar rats: evidence from behavioral, biochemical, histological, and immunohistochemical analyses
编辑推荐：
既往研究表明，Spondias mombin叶中所含植物化学成分具有神经再生及神经保护潜能。因此，本研究采用生物化学、行为学、组织学及免疫组织化学评估，考察了Spondias mombin叶乙醇提取物（ELESM）对东莨菪碱诱导神经变性的成年雄性Wistar大
既往研究表明，Spondias mombin叶中所含植物化学成分具有神经再生及神经保护潜能。因此，本研究采用生物化学、行为学、组织学及免疫组织化学评估，考察了Spondias mombin叶乙醇提取物（ELESM）对东莨菪碱诱导神经变性的成年雄性Wistar大鼠海马的影响。研究历时71天。42只成年雄性Wistar大鼠（200 ± 20 g）被随机分为6组（n = 7）。第I组口服正常盐水（1 mL/kg）10周。第II–VI组通过腹腔注射东莨菪碱（1 mg/kg）2周诱导神经变性。诱导结束24 h后，第II组口服正常盐水（1 mL/kg），第III组口服多奈哌齐（donepezil，5 mg/kg），第IV–VI组分别给予ELESM 200、400和600 mg/kg，持续8周。结果显示，东莨菪碱给药显著升高乙酰胆碱酯酶（AChE）活性、降低抗氧化状态并促进炎症反应。行为学评估显示，自主活动降低、出现焦虑样行为，并伴随工作记忆受损。组织学结果提示神经变性特征，包括齿状回（DG）神经元密度降低，以及海马阿蒙角（CA）各亚区健康神经元比例下降。海马伞层（alveus）白质完整性受损，表现为结构扭曲及致密性下降。免疫组织化学分析进一步显示，星形胶质细胞对氧化应激产生反应性变化。上述发现表明，东莨菪碱可触发并维持超过诱导期的分子与结构性改变。然而，多奈哌齐及ELESM 200 mg/kg、400 mg/kg和600 mg/kg处理均产生显著的抗胆碱酯酶、抗氧化及抗炎作用，使相关蛋白水平恢复至接近正常。多奈哌齐和ELESM改善了认知与记忆功能，并减轻焦虑样行为。海马各亚区的组织学完整性得到保持，而免疫组织化学结果显示星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达受到调节。长期东莨菪碱给药可导致持续性损害，但ELESM对东莨菪碱诱导的神经变性表现出神经保护作用，其机制可能与其抗胆碱酯酶、抗氧化及抗炎特性有关。
该论文发表于《Frontiers in Cellular Neuroscience》，围绕Spondias mombin叶乙醇提取物（ELESM）对东莨菪碱诱导海马神经变性的干预作用展开。研究背景建立在神经变性疾病，尤其是阿尔茨海默病（AD）病理机制的复杂性之上。现有研究认为，氧化应激、神经炎症、胆碱能功能障碍、神经元网络失衡以及胶质细胞反应性改变，共同推动神经元丢失、髓鞘损伤和认知障碍的发生发展。海马作为学习、记忆形成和认知加工的关键脑区，对上述病理改变高度敏感，尤其CA1、CA3及齿状回（DG）等亚区常在疾病早期即发生结构与功能异常。与此同时，星形胶质细胞在维持神经元稳态、调控谷氨酸清除、离子缓冲和能量代谢方面发挥核心作用，但在慢性损伤环境下会出现反应性星形胶质增生（astrogliosis），从而加剧神经炎症。尽管临床上用于AD及相关神经退行性疾病的药物能够缓解症状，但仍存在疗效有限、不良反应、成本较高及可及性不足等问题，因此寻找来源广泛、价格低廉且具有多靶点活性的植物药干预方案，具有明确研究价值。Spondias mombin富含类黄酮、生物碱、皂苷、单宁、萜类和甾体等植物化学成分，既往研究已提示其具有抗氧化、抗炎、增强记忆及调节与神经退行性疾病相关关键酶的潜力，但其对东莨菪碱诱导的海马细胞构筑改变、髓鞘完整性及星形胶质细胞反应的影响仍缺乏系统证据，因此开展本研究具有重要必要性。
研究人员采用东莨菪碱诱导成年雄性Wistar大鼠神经变性模型，系统评价ELESM的海马保护作用。结果表明，东莨菪碱不仅引起胆碱能失衡、氧化应激和炎症增强，还造成海马神经元减少、白质纤维结构损伤以及GFAP表达增强；而多奈哌齐和不同剂量ELESM均可不同程度逆转上述异常，提示ELESM具有明确的神经保护效应。该研究的重要意义在于，从行为学、生化、组织形态学及免疫组织化学多个层面证实了Spondias mombin叶提取物对海马神经变性模型的干预潜能，为植物来源神经保护剂的开发提供了实验依据，也支持其作为阿尔茨海默样神经退行性病变辅助干预候选物的研究价值。
本研究主要采用以下关键技术方法：以42只成年雄性Wistar大鼠为样本，随机分组后以腹腔注射东莨菪碱建立神经变性模型，并分别给予正常盐水、多奈哌齐或不同剂量ELESM持续干预；采用开放场实验（OFT）与Y迷宫实验评估自主活动、焦虑样行为及空间工作记忆；分离海马组织后检测乙酰胆碱酯酶（AChE）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等指标；采用苏木精-伊红（H&E）染色、Luxol fast blue染色及GFAP免疫组织化学观察海马亚区神经元形态、伞层白质完整性与星形胶质细胞反应，并结合图像定量分析进行形态计量学评价。
在研究结果部分，首先是“Body weight assessment”。研究显示，各组体重变化轨迹及体重百分比变化差异均无统计学意义，说明随机分组后基线可比，且东莨菪碱及后续干预未造成显著体重偏移，这有助于排除体重因素对后续神经行为学和生化分析的干扰。
其次是“Cognitive test and memory assessment”。开放场实验显示，东莨菪碱处理显著减少穿格次数、增加不动时间、增加粪便颗粒数量并降低站立次数，提示自主活动下降、探索行为减弱并伴焦虑样行为增强。Y迷宫结果显示，自发交替行为百分比（SAB%）显著下降，说明空间工作记忆受损。多奈哌齐及ELESM干预后，多项行为学指标得到改善，其中ELESM对SAB%的改善呈一定剂量依赖趋势，提示该提取物可减轻东莨菪碱导致的认知和情绪行为异常。
第三部分为“Biochemical evaluations”。在“The effect of ELESM on the acetylcholinesterase activity (AChE)”中，东莨菪碱显著升高海马AChE活性，提示胆碱能系统受损；多奈哌齐及中、高剂量ELESM降低AChE活性，显示抗胆碱酯酶效应。在“The effect of ELESM on the superoxide dismutase activity (SOD)”与“The effect of ELESM on catalase activity (CAT)”中，东莨菪碱显著降低SOD与CAT活性，反映抗氧化防御能力减弱；干预后两项酶活性上升，说明抗氧化系统得到恢复。在“The effect of ELESM on the malondialdehyde concentration (MDA)”中，东莨菪碱导致MDA升高，表明脂质过氧化增强；ELESM及多奈哌齐显著降低MDA，提示其能够减轻氧化损伤。在“The effect of ELESM on the tumour necrosis factor-alpha (TNF-α)”中，东莨菪碱显著升高TNF-α水平，说明炎症反应被激活；ELESM和多奈哌齐均降低TNF-α，且高剂量ELESM效果更突出，支持其抗炎作用。
第四部分是“Histopathological assessment”。H&E染色显示，对照组DG、CA3和CA1神经元排列完整、细胞形态清晰；东莨菪碱组则出现神经元减少、细胞固缩（pyknosis）、深染、坏死样改变及细胞排列紊乱，提示明显神经变性。多奈哌齐及ELESM处理后，海马亚区组织完整性得到保留，健康神经元增多，说明这些干预能够缓解海马神经元损伤。
第五部分是“Quantitative morphometric analysis of hippocampal subregions”。定量分析显示，东莨菪碱显著降低DG颗粒细胞密度，并减少CA1和CA3中具有完整胞体及细胞核的健康神经元比例。相较之下，多奈哌齐及ELESM组细胞密度和健康神经元比例较高，表明提取物在形态计量学层面具有保护作用，可促进神经元存活并维持海马微结构稳定。
第六部分是关于白质与髓鞘结构的结果。Luxol fast blue染色显示，对照组海马伞层（alveus）白质纤维排列紧密、结构规整；东莨菪碱组则出现纤维疏松、断裂倾向和空泡样改变，提示白质完整性受损及脱髓鞘样改变。干预组，尤其多奈哌齐和ELESM处理后，纤维压实度和组织连续性得到改善，表明其对白质结构具有保护作用。
第七部分是“Subfield assessment on the effect of ELESM on astrocyte morphology and GFAP expression in the hippocampus of scopolamine treated rats”。GFAP免疫组织化学显示，对照组CA1、CA3和DG中GFAP免疫反应较弱，星形胶质细胞呈静息状态；东莨菪碱组GFAP阳性增强，细胞体肥大、突起增粗并伴细胞聚集，提示明显反应性星形胶质增生。ELESM可剂量依赖性减弱GFAP免疫反应，400 mg/kg和600 mg/kg组效果接近对照，说明其能够调节胶质细胞反应，减轻由氧化应激和炎症引发的胶质活化。
讨论部分围绕东莨菪碱是否造成持续性而非短暂性损伤，以及ELESM通过何种机制发挥保护作用展开。研究人员指出，尽管短期研究已知东莨菪碱可诱导氧化应激和认知障碍，但本研究设置了较长恢复窗口，结果显示在无干预条件下，AChE升高、SOD与CAT降低、MDA与TNF-α升高、行为缺陷持续存在、海马神经元减少、白质完整性受损及GFAP反应增强，说明东莨菪碱可启动并维持持续的神经退行性过程。与之相对，多奈哌齐和ELESM在抗胆碱酯酶、抗氧化和抗炎多个层面均呈现一致改善效应，并与行为学恢复和组织结构保留相互印证。讨论还指出，ELESM虽然改善认知，但在开放场中的活动度降低可能反映轻度中枢抑制或镇静样作用；不过这种效应并未抵消其神经保护作用，因为其同时提升了工作记忆表现并保留了海马组织完整性。就组织学意义而言，CA1、CA3及DG是学习记忆相关关键亚区，东莨菪碱诱导的神经元减少和结构紊乱与认知障碍具有一致性；而伞层白质纤维的疏松和空泡化则提示髓鞘压实受损，可能进一步干扰记忆编码和传递。GFAP结果则从胶质反应层面支持了氧化应激和炎症持续存在的判断，也表明ELESM能够减轻反应性星形胶质增生，从而维持海马微环境稳态。
研究结论部分可译为：本研究认为，ELESM对成年雄性Wistar大鼠东莨菪碱诱导的神经变性具有神经保护作用，其机制可能主要通过抗胆碱酯酶、抗氧化及抗炎特性介导。
