脯氨酸导向磷酸化与肽基脯氨酰异构相互拮抗调控PSD-95泛素化及兴奋性突触可塑性

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Proline-directed phosphorylation and prolyl isomerization oppose each other to regulate PSD-95 ubiquitination and excitatory synaptic plasticity

　　

摘要：PSD-95是兴奋性突触中的关键支架蛋白(scaffolding protein)，在稳定突触受体方面发挥核心作用。磷酸化(phosphorylation)和泛素化(ubiquitination)等翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)已被证实可调控PSD-95的定位与稳定性。苏氨酸19(T19)位点的磷酸化是参与N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)依赖性长时程抑制(LTD)的关键磷酸化位点，但其对PSD-95泛素化的调控作用尚不清楚。本研究旨在阐明T19磷酸化在调控PSD-95泛素化中的作用，以及已知结合磷酸化T19的肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)是否修饰此过程。研究结果显示，T19和S25(丝氨酸25)的磷酸化正向调控PSD-95泛素化。此外，研究人员发现Pin1与S25的结合降低了T19的磷酸化水平并阻止了PSD-95的泛素化。最后，全细胞记录显示糖原合酶激酶3β(GSK3β)过表达抑制基线突触传递并部分阻断NMDAR-LTD，而这两种效应均可被Pin1过表达挽救。综上所述，这些发现揭示了调节突触部位PSD-95稳定性的分子机制。

论文解读：脯氨酸导向磷酸化与肽基脯氨酰异构相互拮抗调控PSD-95泛素化及兴奋性突触可塑性

该研究发表于《Frontiers in Molecular Neuroscience》。

一、研究背景与目的

突触可塑性(synaptic plasticity)是学习记忆的细胞基础，其中长时程抑制(LTD, long-term depression)依赖N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)激活。突触后密度蛋白-95(PSD-95, postsynaptic density protein-95)作为兴奋性突触关键支架蛋白，其突触稳定性受磷酸化、棕榈酰化及泛素化等翻译后修饰调控。PSD-95 N端含有苏氨酸19(T19)和丝氨酸25(S25)两个经典脯氨酸导向磷酸化位点——T19由糖原合酶激酶3β(GSK3β, glycogen synthase kinase-3β)磷酸化并参与NMDAR-LTD，S25由周期蛋白依赖性激酶5(CDK5, cyclin-dependent kinase 5)磷酸化介导PSD-95不稳定。已有研究表明E3连接酶MDM2介导PSD-95泛素化(ubiquitination)，且S25磷酸化与单体泛素化(monoubiquitination)呈负相关，但T19磷酸化是否及如何调控PSD-95泛素化尚不明确。此外，磷酸化依赖的肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1, peptidyl-prolyl isomerase 1/NIMA-interacting 1)可结合PSD-95 N端磷酸化Ser/Thr-Pro模体并催化cis-trans异构，其对突触支架蛋白泛素化的作用尚未见报道。本研究旨在探明T19/S25磷酸化对PSD-95泛素化的调控关系，以及Pin1在此过程中的作用及其对突触传递和NMDAR-LTD的功能影响。

二、主要关键技术方法

研究人员采用HEK293T细胞共转染HA-标记泛素(HA-Ubiquitin)、野生型及位点突变(T19A、S25A、T19A/S25A)的PSD-95、HA-GSK3β及Pin1质粒，通过免疫沉淀(IP, immunoprecipitation)及Western blot检测PSD-95泛素化水平与磷酸化T19(pT19)水平；使用激酶失活突变体GSK3β(K85A)及Pin1催化失活突变体(K63A)、Pin1抑制剂Juglone处理分析磷酸化动态变化；采用原代大鼠胚胎(E18.5)海马神经元培养物，进行单细胞脂质双分子层全细胞膜片钳(voltage-clamp)记录微小兴奋性突触后电流(mEPSC, miniature excitatory postsynaptic currents)，并以化学诱导LTD(Chem LTD, 20 μM NMDA, 4 mM Ca²⁺/1.2 mM Mg²⁺)评估NMDAR-LTD，分别过表达GSK3β、Pin1或共表达进行功能挽救实验。

三、研究结果

GSK3β regulates PSD-95 ubiquitination（GSK3β调控PSD-95泛素化）

HEK293T细胞中GSK3β过表达显著升高PSD-95 T19磷酸化，激酶失活突变体GSK3β(K85A)降低T19磷酸化。野生型GSK3β过表达对PSD-95总泛素化无显著改变，但K85A突变体使PSD-95泛素化水平显著下降，表明基础T19磷酸化促进PSD-95泛素化，GSK3β与PSD-95的结合及激酶活性参与此调控。

Regulation of PSD-95 ubiquitination by phosphorylation of the N-terminus of PSD-95 by GSK3β and Pin1（PSD-95 N端T19和S25磷酸化调控其泛素化及Pin1的作用）

野生型PSD-95在GSK3β共表达下泛素化增强，Pin1共表达消除该泛素化信号。T19A单突变体中GSK3β仍可提升泛素化但Pin1将其抑制；S25A单突变体及T19A/S25A双突变体几乎检测不到PSD-95泛素化，且Pin1无进一步作用。表明S25磷酸化为PSD-95泛素化所必需，T19具调节作用，Pin1通过该N端磷酸化位点负向调控PSD-95泛素化。

Pin1 regulates the T19 phosphorylation over a slower time scale（Pin1在较慢时间尺度上下调T19磷酸化水平）

短时(数分钟至2小时)过表达Pin1或抑制Pin1活性(Juglone)未引起pT19显著急性变化；但在较长时间尺度(过夜转染)，GSK3β过表达升高pT19，Pin1共表达使pT19水平显著降低。说明Pin1通过构象调节促进T19去磷酸化，此效应发生于较缓慢时间尺度，进而抑制PSD-95泛素化。

Pin1 opposes the GSK3β action on excitatory synaptic strength（Pin1拮抗GSK3β对兴奋性突触传递的作用）

原代海马神经元中GSK3β过表达使mEPSC振幅显著降低(不影响频率)，部分阻断NMDAR-LTD诱导；Pin1共过表达部分挽救mEPSC振幅及LTD表达能力。单独改变Pin1水平不影响基线mEPSC或LTD。表明Pin1在功能上拮抗GSK3β过量活化引起的突触传递抑制及LTD缺损。

四、讨论与结论总结

既往认为PSD-95 N端磷酸化协同GSK3β与CDK5参与LTD，但磷酸化—泛素化偶联机制不清。本研究发现：①S25磷酸化为PSD-95泛素化所必需，T19磷酸化具调节作用，GSK3β可能通过与PSD-95结合并招募泛素连接酶复合物(而非单纯直接磷酸化T19)促进泛素化；②Pin1结合pS25-Pro模体，催化脯氨酰顺反异构使N端构象改变，促进T19去磷酸化，负向调控PSD-95泛素化；③Pin1对T19磷酸化的下调发生在慢时间尺度，符合分子计时器特征；④功能上GSK3β过表达削弱基线传递并阻碍NMDAR-LTD，Pin1共表达可挽救，证明二者在突触可塑性中存在拮抗平衡。

研究结论（翻译）：

本研究表明，PSD-95 N端T19和S25的脯氨酸导向磷酸化正向调控其泛素化，而肽基脯氨酰异构酶Pin1结合磷酸化S25并降低T19磷酸化水平，抑制PSD-95泛素化，从而拮抗GSK3β的作用。GSK3β与Pin1的这种拮抗关系决定了PSD-95在突触的稳定性，并调控基线兴奋性突触传递及NMDAR依赖LTD的诱导。PSD-95泛素化受CDK5介导的S25磷酸化及GSK3β结合协同调控，Pin1则作为负向调节分子通过构象异构促进T19去磷酸化并阻止泛素化。二者平衡是兴奋性突触维持PSD-95支架稳定性及表达突触可塑性的关键分子门控机制。