《Frontiers in Immunology》：HLA DP/DRA molecule regulates systemic inflammation and neuroinflammation, aggravates cognitive impairment and long-term anxiety in murine model of sepsis-associated encephalopathy
编辑推荐：
摘要：脓毒症相关性脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）是脓毒症严重且常见的神经系统并发症，临床表现从轻度意识模糊、谵妄、深度昏迷至严重认知功能障碍不等。既往流行病学及生物信息学研究提示HLA DP及DRA分子在脓毒
摘要：脓毒症相关性脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）是脓毒症严重且常见的神经系统并发症，临床表现从轻度意识模糊、谵妄、深度昏迷至严重认知功能障碍不等。既往流行病学及生物信息学研究提示HLA DP及DRA分子在脓毒症中发挥关键作用，但此类II类分子如何参与SAE认知损害尚不清楚。研究人员采用腹腔污染感染（peritoneal contamination and infection, PCI）模型，对表达人源HLA-DP401/DRA-IAβ-/-基因型的人源化转基因小鼠进行实验，旨在探讨HLA II类单倍型/等位基因对脓毒症的影响并阐明其致认知损害的机制。研究结果表明，导入HLA DP/DRA分子可显著提高脓毒症小鼠死亡率，加重临床症状，并使血清及海马组织中炎性细胞因子水平升高。盲肠 slurry（cecal slurry, CS）注射引起脓毒症小鼠小胶质细胞强烈活化及海马组织严重病理损伤。转录组分析显示，接受PCI处理的HLA-DP/DRA-IAβ-/-小鼠存在大量差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）及显著的线粒体功能障碍。值得注意的是，CS注射可上调IAβ-/-小鼠海马AMPK-α磷酸化水平，而在HLA DP/DRA-IAβ-/-小鼠中未见此现象。一致地，脓毒症诱导HLA DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠出现持续性神经认知缺陷及长期焦虑样行为。综上，本研究为HLA II类分子调控宿主脓毒症反应提供了直接证据，并强调HLA-DP/DRA在加重全身感染严重程度中的关键作用。HLA-DP与HLA-DRA基因的导入协同上调全身及海马炎性细胞因子，恶化临床结局，损害记忆功能并加重长期焦虑样行为。
论文解读：《HLA DP/DRA molecule regulates systemic inflammation and neuroinflammation, aggravates cognitive impairment and long-term anxiety in murine model of sepsis-associated encephalopathy》发表于《Frontiers in Immunology》
研究背景与立项依据
脓毒症（sepsis）是由宿主对感染的失调性炎症反应引起的危及生命的器官功能障碍，高达70%的脓毒症患者会发生脓毒症相关性脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE），表现为注意力、记忆力、执行功能受损及长期认知下降。SAE发病机制涉及全身炎症、血脑屏障（blood-brain brain barrier, BBB）破坏、细胞因子释放、小胶质细胞活化及微循环改变等，但具体神经元病理生理机制仍不完全清楚。主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）II类分子多态性与多种疾病密切相关，既往研究表明HLA-DR表达可预测脓毒症死亡风险，HLA-DP在特定等位型及表达水平下与感染和自身免疫病相关，且HLA II类分子（如CIITA驱动的MHC II）在中枢神经系统病理条件下可上调并促神经炎症，但HLA-DP与HLA-DRA是否协同参与SAE及其具体机制尚无直接体内证据。为此，研究人员利用人源化HLA-DP401/DRA01转基因（Tg）小鼠（背景为IAβ-/-，即小鼠MHC II类分子I-Aβ链缺失），结合PCI（peritoneal contamination and infection）脓毒症模型，系统探究HLA II类分子对脓毒症全身炎症、海马病理、信号通路及长短期神经行为学的影响。
主要关键技术方法概述
研究人员使用人源化HLA-DP401-IAβ-/-、HLA-DRA01-IAβ-/-及双转基因HLA-DP401/DRA01-IAβ-/-（简称HLA-DP/DRA-IAβ-/-）小鼠，对照为IAβ-/-（MHC II缺陷）及C57BL/6J野生型（wild-type, WT），建立盲肠浆（cecal slurry, CS）腹腔注射PCI脓毒症模型并给予美罗培南抗生素支持；通过ELISA检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6；qPCR检测海马炎性因子/趋化因子及HLA分子mRNA；Western blot检测海马AMPK/mTOR通路蛋白；免疫荧光染色Iba1评估小胶质细胞活化；尼氏（Nissl）染色、高尔基（Golgi）染色及透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）观察海马神经元及超微结构；RNA-seq进行海马转录组差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）及KEGG/GO富集分析；采用Barnes迷宫（Barnes maze, BM）评估空间记忆，高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）及开场实验（open field, OF）评估焦虑样行为与探索活动，分别于感染后第14天（D14）、第28天（D28）和第60天（D60）进行行为学测试。
研究结果
HLA DP/DRA expression was elevated in the brain of sepsis patients and HMC3 cells
分析GEO数据集GSE135838发现脓毒症患者脑组织中HLA-DPA1、HLA-DPB1及HLA-DRA mRNA呈上调趋势；LPS联合IFN-γ刺激人小胶质细胞系HMC3后，TNF-α（tumor necrosis factor-α）、IL-1β（interleukin-1β）、IL-6及HLA-DPA1、HLA-DRA mRNA均显著升高。结论：脓毒症时中枢HLA II类分子表达上调，小胶质细胞是HLA-DP/DRA介导中枢炎症的重要效应细胞。
Introduction of HLA DP/DRA molecules led to increased mortality and severe clinical symptoms in experimental sepsis
PCI模型给予1.2 mg/kg CS及6 h后美罗培南治疗，C57BL/6J与HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠7 d生存率相似（约33%）且均低于IAβ-/-PCI小鼠（约43%）；前两者3 d累积小鼠脓毒症评分（Murine Sepsis Score, MSS）显著高于IAβ-/-组。结论：内源性小鼠MHC II（IAβ）缺失减轻急性感染后炎症，而导入人HLA-DP/DRA基因部分逆转此保护作用，加重疾病严重度。
Introduction of HLA-DP and HLA-DRA genes enhanced inflammatory cytokine responses in the serum and hippocampus of septic mice
HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠血清TNF-α、IL-1β水平高于IAβ-/-及WT PCI组；海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及趋化因子Ccl-2、Ccl-3、Cxcl-10、Cxcl-2等mRNA在HLA-DP/DRA-IAβ-/-组中协同上调。结论：HLA-DP与HLA-DRA基因协同增强脓毒症时全身及海马区炎性介质表达。
Sepsis induced microglia activation and severe hippocampal pathological damage
Iba1免疫荧光显示PCI小鼠小胶质细胞胞体增大、荧光强度增高，WT PCI小鼠小胶质细胞绝对计数增加而IAβ-/-背景小鼠未见明显增加；高尔基染色示PCI小鼠CA1区神经元胞体数减少、树突棘密度降低、轴突断裂增多；尼氏染色示HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠CA1及CA3区尼氏小体减少更明显；TEM示D14时PCI小鼠海马线粒体肿胀、嵴断裂、基质空泡化，毛细血管内皮细胞肿胀致管腔狭窄，IAβ-/-背景小鼠血管基底膜不均伴断裂。结论：脓毒症致小胶质细胞活化、神经元及突触损伤、线粒体功能障碍和微血管损伤，HLA-DP/DRA加重上述海马病理改变。
Transcriptional profile patterns of the whole hippocampus revealed mitochondrial dysfunction
RNA-seq显示HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠海马DEGs（1829个）远多于WT（547个）和IAβ-/-（712个）PCI组；与IAβ-/-PCI比，HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠海马线粒体呼吸链（如mt-ATP6、mt-ND3、mt-CO3等）及氧化磷酸化相关基因显著下调，GO/KEGG富集于线粒体呼吸链、氧化磷酸化及活性氧（reactive oxygen species, ROS）通路。结论：HLA-DP/DRA转基因主要通过影响线粒体能量代谢及相关免疫互作重塑感染后海马基因表达。
CS treatment upregulated AMPK-α phosphorylation in IAβ-/-mice but not in HLA-DPDRA-IAβ-/-mice
Western blot显示IAβ-/-PCI小鼠海马p-AMPK/AMPK比值显著升高，而HLA-DP/DRA-IAβ-/-与WT PCI小鼠均无此升高；mTOR磷酸化在各PCI组均升高，cleaved caspase 3在各PCI组下降；nNOS与eNOS无显著变化。结论：HLA-DP/DRA分子使AMPK-α磷酸化恢复至WT水平，抑制了MHC II缺陷背景下出现的AMPK激活，可能与线粒体功能异常共同促成认知损害。
Sepsis induced neurocognitive dysfunction and long-term anxiety in HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI mice
D14时Barnes迷宫示HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠找靶洞潜伏期延长（空间记忆受损）；EPM示IAβ-/-背景PCI小鼠（含HLA-DP/DRA-IAβ-/-及IAβ-/-）在开放臂停留时间及路程少于WT PCI及假手术组（焦虑样行为）；OF示HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠中央区停留时间最短、直立次数最少（探索活动减弱）。D28时焦虑样行为持续存在于HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠，空间记忆有所恢复。D60时EPM与OF仍显示所有PCI小鼠存在长期焦虑样行为及探索减弱。结论：CS注射诱导HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠出现一过性空间记忆缺损、持续性长期焦虑样行为及探索能力下降。
讨论与结论总结
既往研究关注单核细胞HLA-DR下调作为脓毒症免疫抑制标志，但HLA-DP与HLA-DRA在SAE中协同作用未知。本研究通过临床数据分析—细胞实验—人源化小鼠模型三位一体证实：脓毒症患者脑组织及LPS/IFN-γ活化的小胶质细胞中HLA-DPA1/HLA-DRA表达上调；人源化HLA-DP401/DRA01转基因小鼠中，HLA-DP与HLA-DRA协同上调全身及海马炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6及Ccl-2、Cxcl-10等趋化因子），促进小胶质细胞过度活化、BBB破坏、海马神经元及线粒体损伤（线粒体呼吸链基因下调、AMPK-α磷酸化受抑），最终导致脓毒症小鼠空间记忆障碍及长期焦虑样行为。HLA-DP/DRA-IAβ-/-小鼠为研究SAE发病机制及筛选治疗药物提供了较贴近人类HLA背景的动物模型。研究结论：HLA class II分子（特别是HLA-DP与HLA-DRA单倍型）通过放大宿主对细菌感染的全身及局部（海马）炎性反应调控SAE严重程度，为理解SAE遗传易感性及靶向HLA II类分子相关炎症通路提供了直接依据。
