综述：从病理生理学 to 治疗：干细胞及细胞外囊泡介导的糖尿病周围神经病变修复的分子机制

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：From pathophysiology to therapy: molecular mechanisms of stem cell and extracellular vesicle-mediated repair in diabetic peripheral neuropathy

　　

糖尿病周围神经病变（Diabetic Peripheral Neuropathy, DPN）是一种常见的糖尿病并发症，目前缺乏有效的治疗方法。尽管基于干细胞的治疗显示出前景，但其疗效主要归因于旁分泌活性，特别是细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）。本综述审视了DPN的分子病理学，重点关注代谢失调、神经炎症和神经血管功能障碍。研究人员阐明了干细胞及其EVs对抗这些过程的机制，包括激活抗氧化通路（NRF2/HO-1）、重编程免疫信号（M1向M2极化转换）以及促进神经血管再生（PI3K/Akt、MAPK）。研究人员还对旨在增强EVs分子载荷和靶向特异性的工程创新进行了批判性评估。此外，研究人员讨论了这些基于EV的治疗的转化挑战，重点关注标准化生产以确保分子一致性的必要性。研究结论认为，基于EV的无细胞治疗代表了一种新型的DPN再生策略，通过多靶点分子机制发挥作用。

2 糖尿病周围神经病变的临床诊断与病理生理学基础

2.1 临床表现与诊断标准

DPN作为一种典型的对称性、长度依赖性感觉运动多发性神经病变，其临床表现复杂多样，涉及感觉、运动和自主神经功能障碍。症状通常始于肢体远端，呈现特征性感知觉损害模式：早期以严重神经病理性疼痛（如烧灼样、电击样或刺痛）为主，夜间加重并严重干扰睡眠；中期表现为感觉异常，如痛觉过敏、温度感觉异常和蚁走感；晚期进展为感觉丧失，痛、温、触觉减退或消失，显著增加无痛性足溃疡、感染和最终截肢的风险。运动功能障碍同样表现为远端、进行性肌无力和萎缩，尤其影响踝背屈，导致特征性跨阈步态并显著增加跌倒风险。此外，自主神经受累可影响多个系统，表现为心血管调节异常（如体位性低血压、静息心动过速）、胃肠道症状（如胃轻瘫、肠道功能障碍）、泌尿生殖功能障碍和出汗异常，进一步加重疾病负担。

由于DPN临床表现复杂且重叠，其诊断需要多模态评估。核心诊断标准包括：确诊糖尿病或存在糖代谢受损证据；上述典型DPN临床症状；以及至少两项神经生理学或结构检查的客观异常。神经传导速度（NCV）仍是评估大纤维神经功能的关键工具，但其在以疼痛和自主神经症状为主的小纤维神经病变中敏感性有限，需要更精细的技术如皮肤活检评估表皮内神经纤维密度（IENFD）。此外，高分辨率超声和磁共振成像（MRI）可显示神经结构改变。临床实践中，结合筛查工具和评分量表（如Michigan神经病变筛查工具MNSI）可提高检测效率和严重程度分级的准确性。新兴技术包括基于人工智能（AI）的视网膜图像分析，显示出无创DPN风险评估的潜力，代表未来诊断方向。

2.2 病理生理机制

2.2.1 代谢órregulation与氧化应激：分子级联

高血糖作为引发DPN的主要代谢损伤，触发一系列相互关联的分子通路，最终导致细胞功能障碍和氧化应激。在分子水平上，过量葡萄糖通量激活多元醇通路，醛糖还原酶将葡萄糖转化为山梨醇，消耗还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）并耗竭细胞抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）。同时，高血糖驱动晚期糖基化终产物（AGEs）的非酶促形成，AGEs与其受体RAGE结合，激活转录因子NF-κB并促进促炎细胞因子和ROS生成酶的表达。蛋白激酶C-β（PKC-β）亚型过度活化通过减少一氧化氮（NO）生物利用度损害血管功能。这种代谢失调的核心枢纽是线粒体；高血糖诱导的电子供体过度产生破坏电子传递链，导致ROS和活性氮（RNS）大量增加，超过超氧化物歧化酶（SOD）等内源性抗氧化系统的清除能力，造成脂质（如丙二醛MDA）、蛋白质和DNA的氧化损伤。由此产生的氧化应激与内质网（ER）应激密切相关，未折叠蛋白的积累激活肌醇需求酶1α-C/EBP同源蛋白（IRE1α-CHOP）促凋亡轴，导致Caspase-3/12激活和雪旺细胞（SCs）及背根神经节（DRG）神经元的凋亡。

2.2.2 慢性神经炎症与免疫失调：神经系统中的信号通路

DPN进展以慢性神经炎症状态为标志，由持续的分子信号循环驱动。代谢应激作为危险信号激活巨噬细胞等免疫细胞，释放促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）。这些细胞因子反过来激活神经元和胶质细胞内的关键促炎信号通路，包括NF-κB、MAPKs和Toll样受体（TLRs）通路，从而放大炎症级联反应并加剧神经损伤。在脊髓背角，小胶质细胞和星形胶质细胞在糖尿病条件下被激活。这种激活伴随代谢重编程；例如，高血糖通过Akt/叉头框蛋白O1（FOXO1）轴抑制小胶质细胞中的Sirtuin 3（Sirt3），使其代谢转向有氧糖酵解并增强促炎介质产生。TNF-α和IL-1β的释放直接驱动神经元过度兴奋和中枢敏化，构成神经病理性疼痛的基础。小胶质细胞中WNT5a/TRPV1信号轴的异常激活进一步促进其向促炎M1表型极化，加重局部炎症。

2.2.3 神经血管单元（NVU）的结构解体与功能障碍：从细胞交谈到分子信号

NVU由神经元、胶质细胞（尤其是SCs）和血管细胞组成，对神经稳态至关重要。在糖尿病中，其完整性通过一系列分子异常而被破坏。轴突变性是DPN的标志，由涉及无菌α和TIR基序含蛋白1（SARM1）的分子通路介导，触发烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）耗竭、病理性钙内流和线粒体功能障碍。SCs处于NVU功能的中心，糖尿病条件损害SC生理学，降低其增殖和修复能力，增加凋亡，并阻断促再生表型。这些损害源于代谢应激（多元醇通路通量和AGE形成）、氧化损伤（ROS积累超过抗氧化能力）、缺血（微血管功能障碍导致神经缺氧）和炎性细胞因子（活化的巨噬细胞和胶质细胞释放的TNF-α、IL-1β、IL-6）。在高糖条件下，SCs分泌富集特定miRNA（如miR-28、-31a和-130a）的外泌体，这些miRNA被DRG神经元轴突摄取后抑制轴突稳定蛋白DNA甲基转移酶3α、NUMB、SNAP-25和GAP-43，直接导致轴突病理。因此，SC来源的EVs在糖尿病条件下充当传递损伤信号的载体。

3 干细胞治疗DPN：机制、进展与瓶颈

3.1 主要干细胞类型：来源与治疗潜力

间充质干细胞（MSCs）已成为转化研究的主要焦点，因其来源丰富、强大的免疫调节特性和 robust 旁分泌活性。MSCs可从骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织和牙髓等多种组织获得，具有低免疫原性和高体外扩增潜力。累积证据表明，MSCs通过分泌多种生长因子和细胞因子改善DPN中的神经功能障碍和结构损伤，共同促进神经再生、血管生成和炎症消退。内皮祖细胞（EPCs）在促进缺血组织新生血管形成中起关键作用，对DPN具有治疗前景。牙髓干细胞（DPSCs）具有微创采集、多系分化和免疫调节能力，在神经再生和糖尿病相关并发症中显示出显著潜力。

3.2 核心作用机制：向旁分泌分子信号的转变

在DPN治疗中，干细胞的修复作用现被理解为主要通过旁分泌信号介导，涉及多种生物活性因子和EVs的释放，而非直接细胞替代。这种分泌组在分子水平上介导协调的、多模式的反应，涵盖免疫调节、血管生成、神经营养支持和微环境重塑。干细胞分泌大量神经营养因子，包括神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）和血管内皮生长因子（VEGF），这些因子与神经元和SCs上的受体结合，激活促生存和促再生信号级联如PI3K/Akt和MAPK/ERK。其免疫调节效应通过释放IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子以及携带抗炎miRNA的EVs实现。在促进血管生成方面，移植的干细胞归巢至神经血管龛，上调血管生成基因表达并释放VEGF等因子作用于内皮细胞以刺激血管形成。干细胞治疗还能恢复受损的内源性修复能力。

3.3 干细胞治疗DPN的临床转化：挑战与优化策略

尽管干细胞在DPN治疗中潜力可期，其临床转化面临多重挑战。细胞存活率低、持久性差和归巢效率不足是限制疗效的关键因素。干细胞产品的实质性异质性源于组织来源、供体特征、分离方案和培养条件的差异，破坏了可重复性和标准化。安全性方面，尽管短期安全性可接受，免疫原性和长期致瘤风险仍需严格评估，特别是基因修饰细胞。值得注意的是，越来越多的证据表明MSCs的治疗效益主要介导于其分泌组，强烈支持无细胞替代方案的开发。体外预处理MSCs（如模拟缺氧、使用去铁胺）可显著上调其旁分泌效力，从而增强修复能力。

4 EVs：解锁干细胞治疗潜力的无细胞关键

4.1 EVs的生物学特性、来源与治疗优势

EVs是介导细胞间通讯的脂质双层包裹颗粒。其分子载荷包括蛋白质、脂质和核酸（如mRNA、miRNA、线粒体DNA），高度依赖于亲代细胞类型及其生理状态。从临床应用角度，干细胞来源的EVs相比传统药物递送系统和直接干细胞移植具有多项独特优势：缺乏完整细胞结构，避免细胞治疗相关的异位组织形成和致瘤风险，免疫原性显著降低；能高效穿越生物屏障，其纳米级尺寸和脂质双层结构使其能够穿越血脑屏障和血神经屏障；可通过工程化实现精准靶向递送；固有的稳定性和可工程化性使其成为高度通用的靶向分子治疗平台。

4.2 EVs在DPN中的多维修复机制：聚焦分子通路

4.2.1 通过特定分子通路缓解代谢失调和抗氧化应激保护

在糖尿病条件下，EVs通过调节特定分子通路减少代谢紊乱和缓解氧化损伤。MSC-EVs可通过激活靶细胞中的PI3K/Akt信号通路改善胰岛素敏感性，从而正向调节胰岛素受体底物（IRS）磷酸化。在抗氧化防御方面，EVs通过递送关键分子激活剂发挥显著神经保护作用。例如，过表达去乙酰化酶沉默信息调节因子1（SIRT1）的BMSC来源外泌体（Exo-SIRT1）通过激活受体细胞中的NRF2/HO-1抗氧化通路缓解高糖诱导的氧化应激。ADSC-EVs携带的miR-130a-3p通过激活NRF2/缺氧诱导因子1-α（HIF1α）/α-肌动蛋白1（ACTA1）轴增强抗氧化酶活性并减少氧化损伤。此外，经芍药苷预处理的SC来源外泌体通过调节ER应激相关IRE1α通路保护DRG神经元免于凋亡。

4.2.2 通过炎症信号调制实现免疫重编程和抗炎效应

EVs在DPN进展中通过充当抗炎分子信号的关键载体积极重塑免疫微环境。MSC-Exos递送特定miRNA（如let-7a、miR-23a、miR-125b、miR-146a），协同靶向并抑制巨噬细胞和内皮细胞中的TLR4/NF-κB信号级联，导致促炎细胞因子和黏附分子（包括细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1））表达降低。这种分子干预促进巨噬细胞从M1向M2表型极化。工程策略可放大此效应；例如，富集miR-146a的MSC-EVs显示增强的抗炎能力并优先在神经组织积累，显著改善DPN。其他来源的EVs，如装载抗炎药物青藤碱（Sinomenine, SIN）的神经干细胞来源EVs（NSC-EVs@SIN），特异性靶向小胶质细胞并抑制WNT5a/TRPV1信号通路，驱动其向M2表型极化。富集miR-214的SC-EVs similarly减少巨噬细胞浸润并抑制TLR4/NF-κB级联。

4.2.3 通过递送促血管生成和神经营养信号实现神经-血管协调修复

EVs通过协同促进血管生成和神经再生，以递送互补分子信号的方式促进受损神经血管单元的多靶点修复。在刺激血管化方面，ADSC-EVs通过其高表达的miR-130a-3p下调DNA甲基转移酶1（DNMT1）并激活NRF2/HIF1α/ACTA1轴，有效增强血管生成。MSC-Exos直接通过递送成纤维细胞生长因子（FGF）、VEGFA和NGF等生长因子改善内皮细胞功能，这些生长因子与内皮细胞上的受体结合并激活促血管生成通路。周细胞来源纳米囊泡依赖脂质运载蛋白2（Lcn2）激活血管和神经细胞中的PI3K/Akt和MAPK通路，增强再生。关于神经修复，健康SC来源的EVs增加IENFD并促进髓鞘再生。其miRNA载荷，包括miR-21、miR-27a和miR-146a，通过下调再生阻断蛋白如磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）、JNK和Semaphorin 6A（SEMA6A）促进轴突生长和髓鞘形成，从而营造促再生分子环境。

4.3 EVs的工程化与递送技术创新：增强分子载荷和靶向性

为克服天然EVs的固有限制，如靶向特异性不足和治疗效力低下，工程化修饰变得至关重要。内源性修饰涉及预处理亲代细胞或采用遗传操作增强EVs的内在分子载荷。例如，工程化SCs过表达miR-214导致分泌富集此抗炎和促再生miRNA的EVs。外源性修饰聚焦于分离EVs的表面工程以引入靶向配体改善向特定细胞的归巢。例如，将RVG肽与EVs偶联使其靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体。更精密的系统涉及将ZH-1c适配体修饰到NSC-EVs@SIN上，创建ZH-1c-EVs@SIN，实现向小胶质细胞的高效靶向药物递送。先进递送平台如生物材料支架旨在延长局部EV滞留，实现其分子载荷的持续释放。例如，将BMSC-EVs整合到导电性rGO-GelMA-PCL导管中增强神经缺损模型中的血管化和轴突发芽。

5 干细胞和EVs治疗DPN的临床转化：现状、挑战与路径

5.1 临床前研究的现状与局限

目前DPN干细胞和EVs治疗的临床前研究主要依赖动物模型，包括链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病、高脂饮食模型和db/db小鼠。研究表明，BMSCs显著促进糖尿病大鼠的神经功能恢复，改善NCV并促进轴突再生和血管生成，主要通过激活糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）/β-连环蛋白信号通路。干细胞来源EVs，特别是SC-EVs，通过递送miR-214等特定miRNA发挥神经保护和抗炎作用。ADSC-EVs通过转移miR-130a-3p等分子促进SC增殖并抑制凋亡以改善DPN病理。给药途径显著影响疗效和机制结果：局部注射能够实现对受损神经的直接靶向并促进局部微环境修复；系统性静脉递送可能主要通过调节全身炎症和免疫反应发挥作用；鞘内注射直接作用于中枢神经系统外周，在缓解神经炎症和促进神经再生方面具有独特优势。

5.2 临床转化的核心挑战

5.2.1 干细胞治疗相关的安全性挑战

干细胞治疗虽对DPN有前景，但临床应用面临若干安全和功能障碍。移植后细胞存活率低仍是关键限制。虽然MSCs具有免疫调节特性，同种异体移植仍存在免疫排斥风险。致瘤潜力是另一问题，干细胞的自我更新能力若失调可能导致异常生长。此外，糖尿病患者尤其是2型糖尿病患者中，内源性EPCs存在功能缺陷，糖尿病全身环境不仅削弱内源性修复，还限制移植或基因修饰EPCs的疗效。除生物学风险外，干细胞治疗还面临伦理和技术障碍：胚胎干细胞（ESCs）的使用因需要破坏人类胚胎而存在伦理争议；iPSCs虽避免此问题，但引入复杂的制备程序和潜在的遗传不稳定性。

5.2.2 干细胞和EVs基础疗法的转化瓶颈

当前转化努力面临若干量化瓶颈：移植干细胞在72小时内遭遇>90%凋亡，旁分泌功能丧失>50%；干细胞中旁分泌因子表达在不同供体和批次间变化高达三倍，导致临床结果重现性差；系统性递送效率极低，静脉输注干细胞<0.1%到达神经组织，天然EVs循环半衰期仅30-60分钟，>90%被肝脾快速清除，<1%在目标神经积累；常规2D培养难以放大，细胞在扩增过程中趋向衰老并丧失干性；EV制备缺乏标准化，超速离心法每10⁶个干细胞仅产出1-10 μg囊泡，远低于毫克级临床剂量。

5.3 未来前景与前沿方向：精准分子治疗

展望未来，干细胞和EV疗法将通过策略优化和技术创新向精准分子干预推进。组合与个性化方法方面，鉴于DPN的多因素发病机制，组合携带不同分子载荷的工程化EVs（如抗炎miRNAs和促血管生成蛋白）可能比单一策略效果更好。基于分子表型的患者个体化选择（如主导性炎症vs血管功能不全表型）可使每位患者匹配最相关的EV产品。新兴技术方面，基因编辑（如CRISPR/Cas9）可工程化亲代干细胞以稳定修饰分泌EVs的分子载荷，但存在脱靶基因组修饰、Cas9蛋白潜在免疫原性以及生殖系编辑伦理问题等风险。AI和大数据分析可能帮助预测最优EV载荷组成和设计工程策略，但也带来患者数据隐私、算法偏见和深度学习模型"黑箱"性质等挑战。监管和产业化路径方面，迫切需要覆盖从制造到临床验证全价值链的EV基础生物制品综合监管指南，产业链整合、规模化生产降低成本以及设计良好的多中心试验高质量证据将加速临床转化并使DPN患者受益。