一种增强人原始态多能干细胞（hPSCs）先导编辑（Prime Editing）的简便且多功能的基于荧光的方法

《BMC Methods》：A simple and versatile fluorescence-based method to enhance prime editing in human pluripotent stem cells

　　

先导编辑（Prime Editing）是一种多功能且精确的基因组编辑技术，能够实现具有前所未有准确性的靶向修饰。与其他基于CRISPR的方法不同，先导编辑不会诱导双链DNA断裂（Double-Stranded DNA Breaks, DSBs），从而最大限度地减少基因组不稳定性和脱靶效应。该技术可实现精确的插入、缺失和替换，超越了传统基因组编辑方法的局限性。然而，一个主要挑战仍然存在——在人原始态多能干细胞（Human Pluripotent Stem Cells, hPSCs）中编辑效率低下，这限制了其在干细胞研究和再生医学中的更广泛应用。该方案描述了利用瞬时报告系统进行编辑富集的先导诱导核苷酸工程（Prime-Induced Nucleotide Engineering using a Transient Reporter for Editing Enrichment, PINE-TREE），这是一种基于荧光的系统，旨在提高hPSCs中的先导编辑效率。逐步详细描述了质粒构建、转染和克隆分离策略的方法学，以促进先导编辑细胞的实时富集。此外，该方案还包括评估脱靶效应和确认多能性维持的综合方法，确保编辑细胞系的精确性和可靠性。PINE-TREE显著提高了hPSCs中先导编辑的效率，解决了与低编辑率相关的关键局限性。通过实现基于荧光的实时富集，该系统增强了成功编辑细胞的分离，减少了劳动密集型筛选过程的需求。此外，其在多种细胞类型中的适应性以及与各种先导编辑策略的兼容性使其成为基因组工程、疾病建模和再生医学研究人员的宝贵工具。

基因组工程技术的进步彻底改变了研究人员模拟人类疾病、探究基因功能和开发精准治疗手段的能力。在众多前景广阔的工具中，先导编辑作为一种CRISPR衍生技术，能够在不需要双链断裂或供体DNA模板的情况下引入精确的插入、缺失和碱基替换。尽管先导编辑具有高度精确性，但在某些细胞类型中，特别是人原始态多能干细胞（hPSCs）中，该技术仍面临技术挑战。hPSCs因其对DNA损伤的高度敏感性和 robust 的错配修复机制而对基因组编辑具有显著的抵抗性，这严重制约了先导编辑在该领域的应用。为解决上述问题，研究人员开发了PINE-TREE系统（Prime-Induced Nucleotide Engineering using a Transient Reporter for Editing Enrichment），该荧光富集策略最初由Frisch等人于2023年建立，能够显著提高hPSCs中先导编辑的效率并成功回收编辑后的克隆。

PINE-TREE方法利用一个瞬时的、游离型的荧光报告基因来识别和分离在特定基因组位点发生精确单核苷酸编辑的细胞。该系统将先导编辑活性与荧光报告基因偶联，该报告基因直接反映共转染的游离型构建体上的编辑事件。具体而言，蓝色荧光蛋白（BFP）报告基因被设计为在成功的先导编辑后转变为绿色荧光蛋白（GFP），因此只有先导编辑器和先导编辑向导RNA（Prime Editing Guide RNA, pegRNA）均功能性活跃的细胞才会显示GFP信号。这些报告基因阳性细胞可通过流式细胞术（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）进行分离，由于报告基因的激活直接反映了同一细胞内先导编辑的活性，因此分选后的GFP阳性群体相比未分选群体或基于常规转染报告基因的富集策略，表现出显著更高的靶位点基因组编辑频率。与传统的荧光标记编辑器或报告质粒方法不同，后者仅能确认质粒递送或表达，但无法区分具有活性或生产性编辑的细胞，PINE-TREE作为基因组编辑的直接报告系统，能够选择性富集编辑机器功能性参与的细胞。这一特性减少了已摄取质粒但未能成功编辑的细胞的纳入，从而提高了富集效率和下游克隆回收率。

该协议详细描述了利用这一基于荧光的先导编辑富集系统增强hPSCs基因组修饰的方法学流程，涵盖靶位点pegRNA克隆、hPSC培养与扩增、转染以及下游验证等步骤。方法设计中，PINE-TREE目前采用已在hPSCs中验证的PE2和PE3b系统，其中PE3系统因使用额外的切口向导RNA（Nicking Single Guide RNA, nsgRNA）而具有更高的编辑效率。此外，该协议还提供了评估脱靶效应的全面方法，包括利用CCTop等计算工具预测脱靶位点，并通过PCR扩增和Sanger测序进行实验验证，同时确认多能性的维持以确保编辑细胞系的精确性和可靠性。

在技术方法层面，该研究主要采用了以下关键技术：PINE-CONE软件自动化设计pegRNA和nsgRNA序列；基于BbsI-HF、PstI-HF、HindIII-HF和SapI-HF限制酶的阶梯式分子克隆与质粒组装；Lipofectamine? STEM转染试剂对hPSCs进行化学转染；基于BFP-to-GFP荧光转换的实时报告系统；荧光激活细胞分选（FACS）实现单细胞克隆分离；以及通过Sanger测序和EditR软件进行基因型验证，结合免疫荧光染色、三胚层自发分化分析和G显带核型分析进行多能性与基因组完整性表征。样本来源为NCRM-1等人原始态多能干细胞系。

研究结果部分，协议划分为四个主要阶段进行阐述。第一阶段为靶位点pegRNA设计与PINE-CONE应用，研究人员通过PINE-CONE软件自动化设计pegRNA和nsgRNA序列，该软件兼容PE2、PE3和PE3b等多种先导编辑系统，生成经过验证的pegRNA和nsgRNA序列并带有适合克隆的正确突出端。关键设计参数包括引物结合位点（Primer Binding Site, PBS）长度、逆转录酶模板（Reverse Transcriptase Template, RTT）长度以及原间隔区相邻基序（Protospacer-Adjacent Motif, PAM）的接近程度和方向性。PE3b或PE5b系统的应用取决于PAM相对于目标编辑位点的相对位置，这些系统优先于传统的PE3和PE5方法，因为它们仅在逆转录链成功编辑后才引导非编辑DNA链的切口，从而减少indel副产物的频率并提高整体编辑效率。

第二阶段为pegRNA和nsgRNA中间体的克隆与多重化组装。此阶段涉及将U6小分子核RNA启动子分别插入pegRNA和nsgRNA序列上游的中间克隆步骤，随后将两者多重化插入PE-pegRNA(BG)-nsgRNA(BG)载体中的HindIII位点，构建完整的向导RNA表达盒。该策略采用模块化组装方式，通过将向导构建与含有多个U6启动子的最终表达载体分离，提高了克隆效率。

第三阶段为hPSC转染与基于报告基因的细胞富集。hPSCs通过Lipofectamine? STEM转染试剂进行质粒共转染，包括pEF1α-PE2先导编辑器质粒、PE-pegRNA(DT)-nsgRNA(DT)双向导RNA表达质粒和pEF1α-BFP荧光报告质粒。转染后24-48小时，通过荧光显微镜可观察到BFP⁺、GFP⁺和BFP⁺/GFP⁺等不同荧光群体，分别代表未编辑的转染细胞、先导编辑细胞和两者均活跃的细胞。通过FACS分离双阳性（BFP⁺/GFP⁺）细胞，这些细胞表明成功的编辑事件。

第四阶段为克隆扩增、基因型验证与细胞系表征。分选后的单细胞被接种于96孔板中进行克隆扩增，经过约16-20天的培养，游离型质粒逐渐丢失，建立稳定且无转基因的编辑细胞系。通过Sanger测序验证靶位点的编辑状态，EditR软件用于量化分析。验证后的克隆进一步进行多能性维持和基因组完整性表征，包括核心多能性转录因子OCT4、NANOG、SOX2的免疫荧光染色，三胚层（外胚层TUJ1、中胚层α-SMA、内胚层AFP）分化潜能验证，以及通过Cell Line Genetics进行常规G显带核型分析。此外，利用CCTop等工具预测并通过PCR和Sanger测序验证前3-5个预测的脱靶位点，确保编辑细胞系的基因组完整性。

讨论部分，研究人员指出尽管先导编辑相比传统CRISPR/Cas9介导的基因组编辑已显著减少脱靶效应和indel形成，但在治疗或干细胞应用中，基因组完整性至关重要，因此仍需谨慎评估。与Cas9核酸酶诱导DSB并可能导致非所需编辑不同，先导编辑器通过切口酶机制和逆转录酶运作，产生的非预期插入、缺失或重排较少。先前研究已证明PINE-TREE不会增加编辑细胞群体中indel的存在，且富集群体中报告了极少的脱靶效应。研究人员推荐使用PINE-CONE与PINE-TREE联合使用以促进pegRNA和相应nsgRNA的设计，并讨论了将PEmax、PE4、PE5、PE6和PE7等新近发展的先导编辑技术纳入PINE-TREE工作流以进一步提升编辑性能的可能性。

研究结论部分表明，PINE-TREE系统能够在hPSCs中高效生成精确编辑的克隆细胞群体，促进用于发育生物学、疾病建模和再生医学的同源细胞系的建立。该系统最初在hPSCs中开发并验证，但其应用前景广泛，可扩展至包括永生化细胞系和原代细胞在内的多种哺乳动物细胞类型，以及由多能细胞分化的后代细胞如神经元、心肌细胞和肝细胞，从而实现组织特异性变异和表型的建模。通过与新一代编辑系统、改进的递送方法以及更广泛的细胞类型应用的整合，PINE-TREE的实用性将在基础生物学和转化研究中持续扩展。编辑后的hPSC克隆保留了多能性的标志性特征，包括典型的hPSC形态、核心多能性标志物的表达、三胚层分化能力以及正常的二倍体核型，与编辑和扩增过程中基因组完整性的保持相一致。