《Acta Neuropathologica》：Expression of GPR34 in microglia remains stable in human Alzheimer’s disease
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小胶质细胞是人类中枢神经系统（central nervous system，CNS）的常驻免疫细胞，在发育、稳态维持和疾病过程中发挥关键作用。这些功能由广泛的细胞表面受体谱介导，其中包括G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，G
小胶质细胞是人类中枢神经系统（central nervous system，CNS）的常驻免疫细胞，在发育、稳态维持和疾病过程中发挥关键作用。这些功能由广泛的细胞表面受体谱介导，其中包括G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs），如ADP受体P2Y12以及溶血磷脂酰丝氨酸受体GPR34。尽管GPR34缺失已被证实与小胶质细胞吞噬作用受损相关，但其在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）中相对于淀粉样蛋白-β（amyloid-β，Aβ）和tau病理的调控机制仍不明确。研究人员对老年人体体捐献者和组织捐献者在AD谱系中的内侧颞叶皮层（medial temporal lobe cortex，MTLC）开展了小胶质细胞密度、形态及GPR34表达的定量分析。借助荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和免疫标记，研究共分析了187,670个小胶质细胞，并将小胶质细胞参数与Aβ斑块和tau包涵体的严重程度及空间邻近关系进行相关分析。与此同时，研究人员分析了来源于236,002个细胞的人类单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）数据，以评估GPR34在不同小胶质细胞亚型、脑区和神经病理分期中的表达。结果显示，MTLC中小胶质细胞密度及整体形态总体上得以保持，且独立于局部Aβ或高磷酸化tau负荷。除Aβ斑块紧邻区域内小胶质细胞突起出现中度缩短外，未检测到一致性的病理相关形态学变化。GPR34表达表现出显著的细胞间变异性，并在不同小胶质细胞亚型和脑区之间存在差异，但无论是表达强度还是GPR34阳性小胶质细胞比例，均未与Braak分期或Thal分期显示出一致相关性。这些发现提示，人类小胶质细胞中GPR34的调控具有高度情境依赖性，其决定因素更多是区域性与细胞性异质性，而非单独由AD相关病理驱动。
该文发表于《Acta Neuropathologica》，聚焦阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）中人类小胶质细胞（microglia）的表型稳定性及GPR34转录表达特征。研究背景在于：既往大量转基因小鼠模型研究表明，AD相关的淀粉样蛋白-β（amyloid-β，Aβ）沉积与高磷酸化tau（hyperphosphorylated tau，p-tau）可诱导小胶质细胞围绕病灶聚集、发生阿米巴样形态转变，并伴随稳态相关受体如GPR34的显著调控；同时，GPR34作为小胶质细胞高度选择性表达的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），已被证明参与吞噬、炎症信号及免疫应答，因此被视为潜在的AD相关调节分子。然而，小鼠模型并不能完整再现人类AD病理全貌，尤其在人类脑内，小胶质细胞对Aβ和tau沉积的反应模式、GPR34表达是否随病程推进而改变，仍缺乏系统证据。基于此，研究人员希望直接在人类尸检脑组织中验证：转基因鼠中观察到的小胶质细胞变化及GPR34调控，是否同样存在于人类AD脑内。
为回答这一问题，研究人员选取20例不同Braak分期的老年供体脑组织，重点分析内侧颞叶皮层（medial temporal lobe cortex，MTLC）中的内嗅皮层（entorhinal cortex，EC）及颞叶皮层（temporal cortex，TC），因为该区域是tau病理最早出现并逐步扩展的关键解剖区域。研究不仅按传统Braak分期评估病理进展，还进一步量化局部Aβ与AT8阳性tau沉积负荷，并测量单个小胶质细胞与最近病理沉积之间的空间距离，从而在单细胞分辨率上分析小胶质细胞密度、胞体大小、近端突起长度及GPR34 mRNA信号。与此同时，研究人员还纳入SEA-AD公开数据库中的236,002个人类小胶质细胞核转录组数据，从亚型、脑区、Braak分期和Thal分期多个维度系统检验GPR34表达的变化规律。整体结论显示：在人类AD脑中，小胶质细胞密度、整体形态和GPR34表达大体保持稳定，只有Aβ斑块近邻区域出现较轻微的突起缩短；GPR34表达虽然具有明显细胞间、亚型间和脑区间异质性，但并不随AD病理进展呈现稳定上调或下调趋势。该研究的重要意义在于，它对基于小鼠模型形成的“病理沉积驱动小胶质细胞显著激活并重塑GPR34表达”的推断提出了人类组织层面的修正，提示人类AD中小胶质细胞状态更受局部微环境、区域差异和细胞亚型身份影响，而非简单由Aβ或tau负荷决定。
在技术方法方面，研究主要采用三类关键手段。其一，使用来自莱比锡大学相关机构的人类尸检MTLC样本队列，结合AT8免疫分期完成病例筛选与病理分层。其二，在石蜡切片上联合应用荧光原位杂交（FISH）检测GPR34 mRNA、免疫荧光标记Iba1/Aβ或Iba1/AT8，并通过全片扫描、QuPath自动识别与人工校正、图像分割和空间测距，实现单细胞水平的形态及表达定量。其三，利用SEA-AD人类单核RNA测序（snRNA-seq）数据，对多个脑区、不同小胶质细胞亚型中的GPR34阳性比例与表达强度进行供体水平统计分析，并结合Braak分期和Thal分期开展相关性检验。
研究结果部分可以概括如下。
Microglial phenotype and GPR34 expression in relation to AD-related deposits
研究人员通过FISH联合双重免疫荧光，对19例有效供体的187,670个小胶质细胞进行了定量分析，其中EC内116,138个，TC内71,532个。研究核心是将每个Iba1阳性小胶质细胞的密度、形态及GPR34表达与局部Aβ或AT8阳性沉积建立空间关联，从而直接评估AD标志性病理与小胶质细胞状态之间的关系。该部分结果奠定了全文的实证基础。
Case classification by pathological burden
研究以Aβ或p-tau阳性沉积占组织面积百分比定义病理负荷，并将病例分为3级Aβ负荷和4级p-tau负荷。该分层并非仅依据Braak分期，而是结合EC和TC中的实际区域病变范围，从而更精细地反映局部病理严重度。研究据此建立了后续比较小胶质细胞参数变化的定量框架。
Microglial density and morphology remain largely unchanged
通过区域水平定量，研究发现无论在EC还是TC，小胶质细胞密度均未随Aβ或p-tau负荷增加而发生显著变化，区域间也未出现一致差异。形态分析显示，胞体大小与近端突起长度在不同病理负荷类别中总体稳定。虽然胞体增大与突起缩短之间存在负相关，符合静息分枝型向活化阿米巴样状态过渡的一般规律，但这一关系并未体现为AD病理负荷驱动的群体性改变。该结果说明，在人类AD脑的所分析区域内，小胶质细胞并未表现出明显的数量扩增或广泛形态重塑。
Single-cell GPR34 expression is highly variable
研究发现，GPR34 mRNA信号在单细胞层面具有高度异质性。同一区域内，相邻小胶质细胞可表现出明显不同的GPR34信号计数。虽然在高Aβ或高p-tau负荷类别中，GPR34中位信号存在轻度上升趋势，但这种变化在个体间并不一致，且未达到统计学显著性。空间绘图进一步显示，高表达和低表达细胞在组织中呈散在分布，而不是集中于病理沉积区域。这说明GPR34表达差异更多体现为细胞本身及局部背景差异，而非直接反映病理沉积负荷。
Pathology burden influences microglia-to-deposit distance
随着Aβ或p-tau负荷升高，小胶质细胞与最近病理沉积之间的距离显著缩短。也就是说，病理越重，位于沉积周边的小胶质细胞数量越多，且空间分布更趋集中。这一结果主要反映病理沉积本身的扩展和弥散带来的几何后果，而不意味着小胶质细胞主动聚集，因为密度分析并未支持其在沉积周围发生明显簇集。
Distance-dependent microglial responses
在距离分辨分析中，研究以单细胞与最近Aβ或p-tau沉积之间的距离为自变量，考察GPR34信号、局部密度、胞体大小及近端突起长度的变化。结果表明，GPR34表达、局部小胶质细胞密度及胞体大小均未随距Aβ或p-tau沉积远近而呈现一致变化。唯一较明确的距离依赖效应出现在Aβ情境中：越靠近Aβ斑块，小胶质细胞近端突起越短，尤其在0–100 μm范围内更明显，提示斑块邻近处存在轻度去分枝化趋势。相比之下，围绕p-tau沉积的形态变化方向在不同病例之间不一致，未能形成稳定模式。因此，病理相关的小胶质细胞反应在人类脑内是局灶、轻度且选择性的。
GPR34 expression in relation to donor age, PMI, and sex
研究进一步检验了年龄、尸后间隔（post-mortem interval，PMI）和性别对GPR34的影响。FISH结果显示，GPR34信号与供体年龄呈正相关，与PMI呈负相关；女性供体总体上表现出较高的GPR34信号趋势，但未达到显著性。snRNA-seq分析得到相近结果：年龄与GPR34阳性细胞比例及平均表达均呈轻度正相关，PMI与GPR34阳性比例呈负相关。多变量模型中这三项因素未显示独立显著性，说明它们之间可能相互交织，但结果仍提示，人口学和取材因素对GPR34变异的解释力可能不低于AD病理本身。
GPR34 expression across microglial subtypes and brain regions
在236,002个小胶质细胞核的snRNA-seq分析中，47.5%的细胞为GPR34阳性，但不同亚型间差异显著。稳态型P2RY12和TPT1小胶质细胞的GPR34阳性比例及表达强度较高，而活化型DUSP1和中枢神经系统相关巨噬细胞（CNS-associated macrophages，CAMs）相对较低，增殖型MKI67细胞居中。这表明GPR34更接近稳态小胶质细胞标志。不同脑区间也存在显著差异，说明区域微环境对GPR34基线表达具有塑形作用。不过，在供体重叠度较高的若干脑区内，这种区域差异并不总是稳定存在，因此其解释仍需谨慎。
GPR34 expression during disease progression
在病程相关分析中，无论将所有脑区和亚型汇总，还是按脑区×亚型分层，GPR34阳性比例和GPR34平均表达均未与Braak分期或Thal分期形成稳健相关。个别组合在未校正多重比较前可见名义显著，但经Benjamini–Hochberg假发现率（false discovery rate，FDR）校正后均不再显著。这一结果表明，在大样本人类数据中，GPR34不存在可重复的、随AD病理分期单向变化的规律。
讨论部分指出，本研究最重要的发现是：人类AD脑中，小胶质细胞的密度、形态及GPR34表达总体上并未随着Aβ和p-tau沉积而发生显著重塑，这与许多转基因小鼠模型中所见的明显小胶质细胞激活、沉积周围聚集以及稳态基因重编程并不一致。研究人员认为，这种人鼠差异可能来源于多个层面，包括转基因模型中过表达系统带来的人工效应、病理形成机制与人类真实疾病的差异、物种间小胶质细胞转录程序不同、模型动物年龄不足以模拟高龄人脑环境，以及人类AD病理多在晚年背景下发生等。研究同时强调，尸后因素、Iba1标记局限性、白质未纳入分析以及snRNA-seq横断面设计导致的个体异质性，都是解释结果时需要注意的方法学边界。此外，文章特别指出，本研究聚焦于转录层面，GPR34 mRNA稳定并不等于其蛋白水平或信号传导功能恒定，因此不能排除受体配体环境、偶联效率和下游通路活性发生功能性改变的可能。
研究结论可译述如下：总体而言，研究结果强调了高龄、细胞异质性与方法学差异之间的复杂相互作用，这些因素共同塑造了GPR34表达的多样模式。在本研究所分析的老年人脑中，表达GPR34的小胶质细胞与Aβ和p-tau病理之间仅显示出有限关联。GPR34在人类小胶质细胞中的表达主要体现为情境依赖、区域依赖和亚型依赖特征，而不存在与AD分期一致对应的稳健调控。由此可见，尽管小胶质细胞在AD中居于核心位置，但其在真实人脑中的具体作用——无论偏向保护性、损伤性还是相对中性——仍有待进一步澄清。
