《Analyst》：Impact of preparation methods and storage conditions for optimization of the fecal metabolome storage stability
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非靶向粪便代谢组学在过去十年中获得了更高的科学关注，这得益于肠道微生物组代谢重要性的增加。它对分析前变异高度敏感。然而，样品收集、储存和制备对代谢组组成的影响仍未得到充分研究。在本研究中，研究人员系统评估了两种样品制备方案的影响：5% DMSO/水溶解，随后用
非靶向粪便代谢组学在过去十年中获得了更高的科学关注，这得益于肠道微生物组代谢重要性的增加。它对分析前变异高度敏感。然而，样品收集、储存和制备对代谢组组成的影响仍未得到充分研究。在本研究中，研究人员系统评估了两种样品制备方案的影响：5% DMSO/水溶解，随后用甲醇进行溶剂替换，在本研究中称为双液提取（DLE）方案，以及使用FastPrep裂解基质的甲醇均质化。此外，研究人员还考察了在-80 °C冷冻库中的长期储存情况，包括新鲜和冻干样品，有或无甲醇，在样品制备的各个阶段。全局特征覆盖度和灵敏度分析表明，有效的机械均质化对于最大化代谢物回收率至关重要，特别是对于细胞内和微生物衍生的化合物（肠内酯、别石胆酸）。然而，完全去除水分并在纯甲醇中提取导致特征覆盖度降低和信号强度降低，特别是对于极性代谢物如脯氨酸和酪氨酸。在冻干步骤的情况下，在样品制备过程中重新引入水分显著提高了提取效率，强调了维持粪便基质受控水合作用以改善代谢物混合物溶解度的重要性。
研究背景、问题与研究动机：粪便样本是人体健康研究中极为复杂且信息丰富的生物基质之一，其代谢组包含大量内源性、饮食来源、外源性物质、微生物产物以及宿主-微生物组共代谢物，为胃肠道代谢和微生物活性提供了重要窗口。然而，粪便材料在排泄后会因持续的微生物活动、酶促反应、氧气暴露和温度波动而发生生化变化，导致样品组成快速改变。在常规临床工作流程中，样本收集与实验室处理之间的延迟往往不可避免，运输条件、患者依从性和温度差异会显著影响样品组成。因此，从收集到分析的样本处理标准化对于确保可重复和有生物学意义的结果至关重要。储存条件进一步增加了复杂性：新鲜冷冻、冻干或在有机溶剂（如甲醇）中保存等策略对微生物活性、酶活性、代谢物稳定性以及不稳定化合物的降解产物形成具有不同影响。目前，对于何种制备和储存条件最能保留原始粪便代谢组尚无明确共识。此外，样品制备引入了额外变异性——粪便因异质性、含水量变化和高微生物负荷而缺乏标准化的提取策略，且适用于微生物组分析的流程并不适用于全局代谢组学分析。因此，研究人员旨在系统评估样品制备与储存条件组合对粪便代谢组谱的相对影响，为理解工作流程依赖性变异提供比较分析框架。
研究内容与结论：研究人员从一名健康成年志愿者在10天内7次采集粪便样本，每份样本分为33等份，对应11种不同的样品制备和储存条件（每种三个重复），在收集后1小时内处理并置于-80 °C长期储存5-6个月，之后进行LC-MS非靶向代谢组学分析。研究比较了两种提取方案：双液提取（DLE）方案（先冻干，再用5% DMSO/水溶解，最后用甲醇提取）和基于FastPrep裂解基质的甲醇均质化方案（使用裂解基质D或E）。储存条件包括新鲜冷冻、冻干、甲醇储存、均质后储存等。全局特征覆盖度和灵敏度分析显示，基于珠子的均质化结合非冻干样品通常获得更高的特征覆盖度和信号强度；冻干样品在纯甲醇中提取则减少特征数和信号强度。多变量主成分分析（PCA）表明，样品根据提取/均质化方法形成明显聚类；DLE方案形成独立簇，而基于珠子的均质化方案（基质D）分布更广。线性回归模型调整共变量后分析发现：与甲醇均质化相比，DLE方案显著富集了氨基酸（如脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸）、甘氨酸二肽和含氮碱基/核苷（如肌苷、鸟苷），而甲醇均质化则上调了疏水性更强的脂类（如鞘氨醇）和微生物代谢物（如肠内酯）。冻干对比新鲜样品：冻干导致大多数特征下调（2649个上调vs 147个下调），特别是极性代谢物（如泛酸、脯氨酸）在新鲜样品中提取效率更高。甲醇储存对比非甲醇储存：甲醇储存仅引起全局层面的微小变化，但显著影响381个特征，某些代谢物（如N-乙酰苯丙氨酸、黄嘌呤、尿嘧啶）在甲醇储存中降低；尿嘧啶水平主要受提取化学影响而非提取时机。样品制备时机（储存前完全制备vs储存后制备）引起部分PCA分离，但效应较小。研究还比较了裂解基质E与基质D：基质E因含有更小的珠子，对微生物细胞破碎更有效，显著增强了对碳水化合物、莽草酸类和生物碱（如烟酸、腺嘌呤）的提取。研究结论表明，选择样品制备和储存策略应基于分析目标：广泛非靶向覆盖推荐使用珠子均质化的非冻干样品；极性代谢物需保留或重新引入水分；甲醇储存仅引入温和全局变异但可能选择性影响特定代谢物类别；DLE方案在制备和储存条件间提供稳定性能。该研究发表在《Analyst》。
关键技术与方法：研究人员使用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）在电喷雾电离（ESI）正负离子模式下对粪便代谢组进行非靶向分析，色谱分离采用Acquity UPLC HSS T3反相柱。样品制备包括双液提取（DLE）方案（先冻干，再以5% DMSO/水溶解，超声后离心，上清冻干，再以少量水复溶后再加甲醇提取）以及基于FastPrep的珠子均质化方案（使用裂解基质D或E，以甲醇作为均质化溶剂）。数据预处理使用XCMS R包进行峰检测和保留时间校正，通过随机森林系统误差去除（SERRF）进行归一化。统计使用线性回归模型调整采样日等协变量，计算估计边际均值（EMM）进行差异分析，并利用SIRIUS平台及内部标准品库进行代谢物鉴定，结合NPClassifier进行通路分类。样本来自一名健康志愿者，在10天内7次重复采集。
研究结果：
**全局特征覆盖度与灵敏度分析**：通过分析15658个非靶向特征，发现不同条件下稳定检测的特征数在1000-5000之间变化。采用珠子均质化的非冻干方案通常获得更广的特征覆盖度和更高信号强度；冻干后纯甲醇提取的方案特征数和信号强度均较低。DLE方案在全局选择性和灵敏度上表现中等，但对制备和储存条件变异表现出较强的稳健性。然而，与日间变异性相比，这些差异较小。
**样品制备方案（DLE vs 珠子均质化）**：线性回归模型（调整采样日、冻干状态、甲醇储存）显示，DLE方案显著上调了氨基酸（脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、色氨酸）和含甘氨酸二肽（如甘氨酰-苯丙氨酸），以及杂环核碱基/核苷（肌苷、鸟苷、尿嘧啶）；甲醇均质化则上调了疏水性的脂类（十六碳鞘氨醇、鞘氨醇）和微生物代谢物（肠内酯、茄啶）。肠内酯在DLE条件下提取效率较低，可能与水溶液中的水解有关。
**冻干效应**：对比新鲜与冻干样品，线性模型（调整采样日、制备方案、甲醇储存）发现冻干导致2649个特征上调、147个特征下调。新鲜样品中显著富集的代谢物包括泛酸、胞孢菌酸、烟酸、黄嘌呤以及脯氨酸、缬氨酰-缬氨酸、眼酸等氨基酸衍生物，表明冻干后在纯甲醇中提取降低了极性代谢物的回收率。
**甲醇储存效应**：甲醇储存与无甲醇储存的PCA显示全局重叠但微小偏移。线性模型（调整采样日、制备方案、冻干状态）发现甲醇储存显著影响381个特征。N-乙酰苯丙氨酸和烟酸在甲醇储存中降低，而尿嘧啶水平主要受提取化学影响，与储存时机无关。
**制备时机（储存前制备 vs 储存后制备）**：PCA显示部分分离，但效应较小。完成大部分提取步骤后再储存可潜在降低变异。
**裂解基质E vs 基质D**：对比条件9（基质E）与条件6（基质D），显示超过700个特征差异显著。基质E优先提取碳水化合物、莽草酸类和生物碱（烟酸、腺嘌呤、鸟嘌呤），与其改善微生物细胞破碎的设计一致。
总结与讨论：研究结论部分指出，本研究对多种样品制备和长期储存条件组合进行了全面代谢组学评估，揭示长期甲醇储存引起代谢组谱偏移，特别是嘌呤和嘧啶相关代谢物；全局选择性/灵敏度差异相比日间变异性较小，但化合物类别的可重复偏好表明推荐珠子均质化的非冻干方案以获得广泛覆盖；若需冻干，提取前复原水对极性代谢物重要；DLE方案提供稳定性能。研究强调选择策略应基于分析目标，维持所有样本相同处理程序是减少技术变异的根本。这些发现为可控实验设计中的方法选择提供新信息，但向临床或人群研究的转化需进一步验证。
