分析化学家的机遇与挑战：器官芯片(Organ-on-Chip, OoC)装置作为新型替代方法(New Approach Methods, NAMs)用于潜在毒物识别

《Analyst》：Opportunities and challenges for analytical chemists: organ-on-chip devices as new approach methods (NAMs) for identifying potential toxins

　　

新型替代方法(New Approach Methods, NAMs)整合并利用体外(in vitro)和计算机模拟(in silico)方法以预测人体对新化学物质实体(new chemical entities, NCEs)的反应。器官芯片(Organ-on-Chip, OoC)装置代表了先进的体外模型，能最佳地模拟器官水平功能。当前的装置创新速度远超其融入现有工作流程的进程，而现有流程依赖单层细胞培养和动物模型，二者均已被证明对人体NCE毒性预测能力较差。本述评强调了研究人员认为OoC装置欲在现有组织培养实验室中满足提升预测力和重现性所需的生物学与技术要求的准则：包含细胞外基质(extracellular matrices, ECMs)和细胞区室化的解剖学相关结构、用于长期研究的连续灌注、以及能够收集足量可量化分析样品的设计。具体而言，研究人员聚焦于易于获取的制备与分析方法的进展，这些进展使OoC模型正成为组织培养实验室从单层培养转向更复杂模型时的可行方案。研究人员指出，OoC装置的推广受限并非源于生物学相关性不足，而是缺乏标准化监管基准及与现有实验流程兼容性不足。

论文解读：《Opportunities and challenges for analytical chemists: organ-on-chip devices as new approach methods (NAMs) for identifying potential toxins》（发表于《Analyst》）

一、研究背景与意义

传统临床前药物/化学品毒性评价依赖二维(2D)单层细胞培养和动物模型。约30%的候选药物在临床 trial 或上市后仍出现器官特异性毒性，尤其是肝毒性常导致撤市，说明现有模型无法预测人体特异质反应(idiosyncratic responses)。单层培养难以维持关键代谢通路，动物种属差异大。FDA现代化法案2.0(FDA Modernization Act 2.0)允许以NAMs（含in vitro和in silico工具）替代动物试验。三维类球体(spheroids)、类器官(organoids)较2D有所改善，但存在自发形成尺寸不均、通量低、难长期灌注等问题。器官芯片(Organ-on-Chip, OoC)作为先进in vitro NAMs，可模拟解剖结构与生理微环境，但其普及受限于与常规实验室流程不兼容、缺乏标准化及样品量少难做组学分析。本文旨在阐明OoC应用于新化学物质实体(New Chemical Entity, NCE)毒性筛选所需的三大要素，并推介低成本、可及性高的制备方案以助传统实验室过渡。

二、主要关键技术方法

研究人员采用文献综述与自身工作相结合的方法进行述评分析。关键技术路线包括：(1)使用多孔纸支架(paper scaffolds)或3D打印/激光切割部件构建具解剖相关结构的细胞培养单元；(2)搭建连续灌注(continuous perfusion)微流控或毫流控(millifluidic)系统（含泵驱动管路及无管重力倾斜式系统），以维持营养/废物交换及生理剪切力(shear stress)；(3)通过酶解回收支架内细胞/基质，结合分析物富集(analyte enrichment)与信号放大(signal amplification)策略（如ELISA、单分子阵列Single-molecule array, SIMOA、RT-qPCR及LC-MS/MS）对微量样品进行靶向或发现型组学分析；(4)以已知肝毒性药物库（参照NIH LiverTox数据库）平行测试OoC与单层培养，评估预测力与实验室间重现性。无独立患者样本队列，属perspective述评。

三、研究结果

Beyond the monolayer: analytical challenges of fabricating and measuring cellular responses in tissue- and organ-like structures（超越单层：组织/器官样结构中细胞响应制备与检测的分析挑战）

指出即使标准2D培养也存室内/室间重现性问题，需像MIQE(Minimal Information for Quantitative Real-Time PCR Experiments)那样规范细胞"试剂化"管理。OoC借层流控制试剂递送，将细胞按3D架构排布于特定ECM中，通过细胞间动态信号互作维持功能。强调需实时监测胞外氧、pH、葡萄糖以区分生物变异与培养条件波动，并分别测定共培养中各细胞型剂量-反应关系。

Goal 1. Anatomically relevant tissue structures（目标1：解剖学相关的组织结构）

广义上皮屏障由上皮细胞（紧密连接极化）、基膜(basement membrane)及间质细胞(stromal cells)构成。Transwell多孔膜可分隔细胞但有局限（难维持梯度、不利实时分析）。研究人员列举用高级微加工（激光图案化微血管网络、PDMS肝小叶芯片）及易获取方法（台式铣PMMA配水凝胶、电纺多孔支架堆叠）构建含ECM和细胞分区的解剖相关结构，后者更易被生物实验室采纳且水凝胶可拆卸供后续分析。

Goal 2. Continuous perfusion to maintain and evaluate functional tissue and organ microenvironments（目标2：维持并评估功能组织/器官微环境的连续灌注）

静态培养致周细胞缺氧(pericellular hypoxia)触发缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)重编程及酸化（糖酵解→乳酸）。OoC选用透气材料（硅胶水凝胶、热塑性塑料）并以连续流克服扩散限制；微升/分钟级流速下总耗材少于孔板。流动剪切应力影响内皮/间质/上皮细胞极性及迁移，需模拟生理值。举例：牺牲明胶墨水打印灌流管腔、无泵倾斜往复流、带磁搅拌子闭路循环3D打印器件，均实现介质更新且无外接管路气泡困扰。

Goal 3. Ease of sample collection and scale-up for quantitative measurements of cellular responses（目标3：便于样品采集与放大以满足细胞响应定量测定）

微通道内细胞/液体体积极小（例：1 mm×20 mm通道单层MCF7约6.3×10⁴细胞，仅产~1.9 μg总RNA），难达流式分选或常规蛋白组所需细胞数；放大需重构芯片或合并多器件（致丢失个体响应、降统计力）。透明材质兼容共聚焦成像；对低丰度靶可通过免疫捕获/RNA纯化富集及酶/荧光信号放大（ELISA检出pg级蛋白，SIMOA达fg级）。单细胞技术可揭示异质性但成本高。预成型多孔支架可按比例放大直径/厚度以获取足量的细胞/ECM，兼容标准裂解与下游试剂盒。

Cell-containing scaffolds for generating scalable tissue- and organ-on-demand structures（含细胞支架用于按需生成可放大组织/器官结构）

为降低OoC门槛，研究人员采用预成型多孔支架（纸、丝素蛋白、PET底+硅胶框）载入细胞水凝胶，可模拟肝、肾、心脏等及多器官串联。支架支持酶解回收细胞做PCR、MS代谢物分析、共聚焦固定染色。连续灌注可通过毛细作用或3D打印夹持器外接蠕动泵实现双腔分室灌注并允许旁分泌信号交流。此类支架桥接了生理相关架构与常规实验可及性。

Increased acceptance and adoption of NAMs is through standardization and detailed experimental evaluation（通过标准化与详尽实验评估提升NAMs接受度与采用率）

监管接纳需明确基准。建议：(1)建立已知NCE（临床失败/成功）参考化合物库在相同条件下测试NAMs并与单层平行对照；(2)资助室间比对研究验证技术就绪度(Technology Readiness Level, TRL)。推荐利用LiverTox数据库做肝NAM效能评估，先完成室内不同操作者重复实验确认重现性，再建可检索NAM社区数据库比较预测结果与易用性。"若两装置预测力相当，哪一装置更适于广泛采用？"是未来选型核心。

四、讨论与结论总结

研究人员认为OoC推广瓶颈不在生物学保真度而在缺乏标准化监管基准及与既有工作流程兼容差。分析化学家在开发NAMs及验证OoC装置中扮演关键角色——无论用高级微加工或创客空间(makerspace)工具（3D打印、激光切割），预测力取决于对NCE响应的精确测量。未来路径为双轨并行：(1)制定所有工具之基准路线图与数据集比对框架以辨优劣；(2)提供低准入门槛、可产出有意义数据集的工具助传统实验室迈入微流控领域。预成型多孔支架+连续灌注+适配采样放大构成务实过渡方案。最终呼应FDA现代化法案2.0目标：在确保解剖/生理相关性、可控灌注及技术实用性的同时，通过标准化推动NAMs在毒性筛查中的监管认可与广泛应用。