重塑辅助卵母细胞激活：一种更符合生理机制的方法

《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》：Assisted oocyte activation re-envisioned: a more physiological approach

　　

目的：确定卵胞浆内单精子注射（ICSI）后严重或完全受精失败的配子特异性病因，并评估由精子磷脂酶C-ζ（PLCζ）含量指导的个体化辅助卵母细胞激活（AOA）策略的有效性。

方法：研究人员首先开展了一项关于射出精子、附睾精子和睾丸精子中PLCζ含量的预实验性拓扑分析，以更好理解不同成熟阶段精子的受精能力。该前瞻性病例系列共纳入135对在ICSI后发生完全或严重受精失败的夫妇，对其进行PLCζ含量筛查，并依据PLCζ检测结果分配为卵母细胞相关缺陷或精子相关缺陷。根据配子特异性缺陷，治疗周期接受AOA处理，即单用离子载体（ionophore）、单用重组人PLCζ（rhPLCζ）或联合处理。将AOA治疗周期的胚胎学结局和临床结局与历史非AOA ICSI周期进行比较。

结果：在预实验研究中，PLCζ含量随精子的成熟度和来源不同而变化。与历史周期相比，采用离子载体和rhPLCζ的AOA均可挽救受精并改善妊娠结局，且效率相当。值得注意的是，双重AOA（ionophore + rhPLCζ）在受精率（24.1% 对 73.2%，P < 0.0001）、着床率（6.5% 对 31.7%，P < 0.01）和持续妊娠率（0% 对 63.3%，P < 0.0001）方面带来了最大改善，即使在使用睾丸精子的周期中亦然。

结论：重组PLCζ的引入使配子特异性受精失败得以实现针对性纠正。双重AOA（ionophore + rhPLCζ）在复合病因病例及未成熟精子相关病例中特别有效，支持辅助卵母细胞激活策略由经验性应用向个体化应用转变。

该文发表于《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》，围绕辅助生殖领域中卵胞浆内单精子注射（ICSI）后仍然发生严重或完全受精失败这一临床难题展开。常规体外受精（IVF）虽然显著改善了不孕症治疗，但在精子数量有限、运动能力差或无法穿透透明带的情况下，仍可能发生受精失败。ICSI通过将单个精子直接注入卵母细胞胞浆，克服了许多传统受精障碍，因此成为辅助生殖技术（ART）中的核心方法。然而，即便采用ICSI，仍有1%–3%的周期出现完全受精失败，且在更大比例患者中可见严重低受精率。这类患者往往是辅助生殖中最棘手的人群之一，传统经验性处理策略并不能稳定改善结局，因此有必要从机制层面重新界定受精失败的来源，并据此设计更精准的干预方案。

受精过程中，精子进入卵母细胞后释放磷脂酶C-ζ（PLCζ，精子来源的卵母细胞激活因子），诱导胞内Ca²⁺振荡，从而启动卵母细胞激活。若精子缺乏功能性PLCζ，例如存在PLCZ1突变、圆头精子症（globozoospermia）等结构异常，或使用成熟度较低的睾丸来源精子，则可能无法触发正常Ca²⁺信号，进而导致受精失败。现有的辅助卵母细胞激活（AOA）多采用钙离子载体，其优势是操作简便、重复性较好，但其本质上仅诱导一次非同步的钙升高，未必能够模拟生理性受精所需的持续振荡，因此对精子因素所致的激活障碍疗效并不稳定。另一方面，部分受精失败也可能与卵母细胞因素有关，如卵母细胞胞浆成熟不足或激活通路分子缺陷，但相关机制尚未完全阐明。基于此，研究人员提出，应以更符合生理机制的方式重建卵母细胞激活，并依据不同配子缺陷实施个体化AOA，而不是继续沿用经验性统一处理。

研究方法概括：本研究为前瞻性病例系列，纳入25年间ICSI后完全受精失败或持续低受精率（2PN率<30%）的135对夫妇，并将AOA治疗周期与其12个月内历史非AOA周期比较。研究人员首先在正常生精但因射精精子DNA碎片高而接受手术取精的男性中，比较射出精子、附睾精子和睾丸精子的PLCζ分布。随后采用精子PLCζ免疫荧光检测，并以≥30% PLCζ阳性为正常阈值，将病例区分为卵母细胞相关或精子相关受精失败；同时结合精子基因测序评估相关突变。根据病因分别给予单纯离子载体AOA、单纯rhPLCζ-AOA或双重AOA（rhPLCζ联合离子载体），并对部分睾丸取精周期进行亚组分析；rhPLCζ在应用于人类配子前先以小鼠MII卵母细胞进行了活化验证。

在结果部分，论文首先以“Fertilization capability according to sperm maturity and origin”为题，分析不同成熟阶段及不同解剖来源精子的受精潜能。研究人员在先导性研究中发现，睾丸精子的PLCζ水平最低，附睾精子和射出精子依次升高。这一结果表明，精子成熟过程与PLCζ积累密切相关，也解释了睾丸精子作为较未成熟雄配子时通常受精能力较低。该发现为后续为何睾丸取精病例需要更积极的AOA干预提供了机制依据。

在“PLCZ level and semen characteristics”部分，研究纳入的135对夫妇既往平均2PN受精率仅19.6%，提示整体为严重受精障碍人群。常规精液参数包括体积、浓度、活力和正常形态在不同患者分类中并不能充分揭示受精失败机制，而PLCζ水平存在明显差异。进一步的二代测序分析还检出多类与受精相关的基因异常，包括参与精卵结合、精母细胞减数分裂分化、钙信号转导以及受精过程中细胞信号调控的基因突变，并识别到PLCZ1突变。这部分结果说明，单纯依赖传统精液分析不足以识别精子来源的卵母细胞激活障碍，PLCζ检测结合基因分析更有助于病因分层。

在“Efficiency of rhPLCζ”部分，研究人员首先验证了重组人PLCζ（rhPLCζ）的生物学活性。于小鼠MII卵母细胞模型中，rhPLCζ注射后的活化率为76.0%，与钙离子载体处理组的80.0%相近，而假注射组和未操作组均未出现极体排出或原核形成。该结果说明rhPLCζ具备较强的卵母细胞激活能力，为其后续临床应用提供了实验支持。

在“Ionophore-only AOA boosts fertilization in oocyte-related activation deficiency”部分，研究人员将PLCζ水平正常、推定为卵母细胞相关激活障碍的患者给予单纯离子载体AOA。与历史周期相比，该组受精率由17.3%显著提高至52.5%（P < 0.0001），并且移植周期中54.8%获得持续妊娠或分娩，而历史周期无持续妊娠（P < 0.001）。在既往完全受精失败的亚组中，受精率由0提升至50.3%，妊娠率达43.8%。这些数据表明，对于精子PLCζ储备正常、问题更可能位于卵母细胞胞浆能力或激活响应环节的患者，离子载体AOA能够有效改善受精并带来临床获益。

在“rhPLCζ-only AOA rescued fertilization deficiency in spermatozoa lacking endogenous PLCζ”部分，研究人员针对精子内源性PLCζ缺乏的病例实施单纯rhPLCζ-AOA。结果显示，与历史周期相比，卵母细胞活化率由19.9%升至47.9%，受精率由18.3%升至41.4%，差异均具有统计学意义（P < 0.0001）。持续妊娠或分娩率达到29.4%，而历史周期为0。在5对既往完全受精失败且病因明确为精子相关激活障碍的夫妇中，受精率由0%升至47.8%，随后妊娠率为33.3%。该部分直接证明，针对缺失的精子激活因子进行替代补充，能够更有针对性地纠正精子因素所致的受精缺陷。

在“Dual AOA targeting borderline, combined, and unexplained etiology of oocyte activation deficiency”部分，研究人员对PLCζ处于临界水平、病因不明或兼具卵母细胞与精子双重因素的患者采用双重AOA，即rhPLCζ与离子载体联合。该策略取得了全研究中最显著的改善：总活化率由27.8%升至86.8%，2PN率由24.1%升至73.2%，着床率由6.5%升至31.7%，持续妊娠或分娩率由0升至63.3%，且未观察到妊娠丢失。在既往0%受精的亚组中，双重AOA将受精率提高至68.8%，妊娠率为40.0%。这一部分说明，联合策略特别适用于病因复杂或单一机制无法充分解释的受精失败，可同时弥补精子触发信号不足与卵母细胞响应不足两方面缺陷。

在“Dual AOA normalized fertilization competence of testicular spermatozoa”部分，研究人员对使用睾丸精子的周期进行了亚组分析。结果显示，双重AOA使活化率由28.5%提高至92.2%，受精率由27.1%提高至74.8%，均达到显著差异（P < 0.0001）。虽然着床率和持续妊娠率在统计学上未达显著，但联合AOA周期中63.6%获得持续妊娠或分娩，而历史周期为0，且未见妊娠丢失。这些结果与先导研究中睾丸精子PLCζ最低的发现相互印证，说明对未成熟精子相关病例，双重AOA具有明显的补偿作用。

在“Overall success of AOA in treating patients with recurrent poor ICSI fertilization”部分，研究人员将全部215个AOA治疗周期与173个历史非AOA周期进行总体比较。两组在男女年龄、获卵数及注射MII卵比例方面无显著差异，提示比较基线相对可比。总体来看，AOA显著提高总活化率（66.4% 对 23.9%，P < 0.0001）和正常受精率（56.1% 对 19.6%，P < 0.0001），着床率也由9.0%升至29.2%（P < 0.001）。更重要的是，AOA治疗后超过半数移植周期获得持续妊娠或分娩（51.7%），而历史周期无持续妊娠（P < 0.0001）；妊娠丢失率也由100%降至4.6%（P < 0.0001）。这表明AOA并非仅改善实验室层面的受精，而是与更实质性的临床妊娠获益相关。

讨论部分围绕“从经验性AOA转向机制导向、个体化AOA”的核心思想展开。研究人员指出，ICSI已解决多数受精障碍，但仍有一部分患者反复遭遇严重受精失败，传统离子载体AOA虽应用广泛，却不能充分补偿所有生物学缺陷。该研究首先通过精子不同来源的PLCζ拓扑分布，说明睾丸精子因成熟不足而PLCζ含量偏低，从而解释其受精潜能不足。其次，研究通过PLCζ检测揭示，常规精液分析无法准确识别精子相关卵母细胞激活障碍，而PLCζ可作为更具机制意义的诊断指标，并可结合基因检测提升病因判定准确性。对于卵母细胞相关因素，离子载体AOA可明显改善受精和妊娠结局；对于精子因素，rhPLCζ补充则提供了更加生理化、更加精准的替代方案。尤其在混合病因、边界性PLCζ水平和睾丸取精周期中，双重AOA显示出优于单一方案的效果，提示两种手段可能分别针对不同环节发挥互补作用。研究同时提到儿童随访未见早期不良结局，但由于样本量有限，尤其睾丸精子病例较少，且受精失败本身发生率低，因此着床和持续妊娠等结局仍应谨慎解读。尽管如此，该研究针对的是历来最难治疗的人群，因此其结果具有明确的临床价值。

研究结论可译为：本研究提供了有力证据，表明在精子PLCζ含量指导下实施个体化AOA策略，能够识别导致受精失败的配子特异性缺陷，并以靶向方式改善受精结局和临床结局。离子载体与rhPLCζ联合的双重方案在混合病因、不明病因以及使用睾丸精子的周期中尤其具有优势。这些发现突出了超越经验性离子载体使用、转向基于机制的AOA策略的新颖性与临床意义，并有望重新定义辅助生殖领域中这一最具挑战性问题的标准处理方式。