利用Goofy/123Cre谱系示踪在神经元迁移过程中区分嗅觉与犁鼻神经元与GnRH-1及终神经（Terminal Nerve）神经元，并揭示脑内额外源于嗅基板（Olfactory Placode）的细胞

《Developmental Dynamics》：Goofy/123Cre lineage tracing differentiates olfactory and vomeronasal neurons from GnRH-1 and terminal nerve neurons during neuronal migration and reveals additional olfactory placode-derived cells in the brain

　　

摘要：嗅基板（Olfactory Placode, OP）在鼻腔区域产生广泛的化学感觉神经元，包括主嗅感觉神经元（Olfactory Sensory Neurons, OSNs）、犁鼻感觉神经元（Vomeronasal Sensory Neurons, VSNs）、隔器（Septal Organ）神经元及Grüneberg神经节（Grueneberg Ganglion, GG）神经元。在嗅基板内陷过程中，OP还产生迁移神经元群，包括促性腺激素释放激素-1（Gonadotropin-Releasing Hormone-1, GnRH-1）神经元、生长抑素（Somatostatin, Sst）表达神经元及前动力蛋白受体2（Prokineticin Receptor 2, Prokr2）阳性的先驱/终神经（Terminal Nerve, TN）神经元。尽管已有大量研究，许多OP来源神经元的遗传谱系与分子特征仍不明确。GnRH-1神经元对生殖功能及化学感觉处理至关重要，但在遗传学上与嗅/犁鼻感觉神经元不同。调控因子Goofy/Gfy表达于基板来源的化学感觉神经元。本研究旨在确定其表达是否仅限于此类神经元或与OP衍生物共享。123Cre小鼠在Gfy1启动子驱动下表达Cre重组酶。对各胚胎期阶段的Cre示踪分析显示，Gfy驱动的重组广泛出现于化学感觉神经元中，但不出现于迁移中的GnRH-1神经元。然而在发育晚期及出生后阶段，部分Gfy示踪细胞出现在基底前脑（Basal Forebrain），其中包括GnRH阳性神经元亚群。这些发现证明了鼻腔迁移神经元群的异质性，提示除GnRH-1外，其他鼻源神经元也定植于前脑。出生后对犁鼻神经元的研究揭示了两类主要VSN亚型具有不同的发育轨迹。

论文解读：Goofy/123Cre谱系示踪区分嗅基板来源的嗅/犁鼻神经元与GnRH-1及终神经（TN）神经元

研究背景与意义

嗅基板（Olfactory Placode, OP）是外胚层增厚结构，不仅产生主嗅上皮（Main Olfactory Epithelium, OE）、犁鼻器（Vomeronasal Organ, VNO）、隔器和Grüneberg神经节（GG）中的化学感觉神经元，还在E10.5–E11.5早期产生从鼻腔向发育中前脑迁移的神经元群，包括GnRH-1神经元、终神经/先驱神经元（Terminal Nerve/Pioneer Neurons，标记基因为Prokr2）及嗅先驱神经元。GnRH-1神经元已被确证源于OP，但其与化学感觉神经元在分子与遗传谱系上存在差异（如GnRH-1表达Isl1，Gli3突变不影响GnRH-1但破坏嗅/犁鼻发生）。目前早期迁移神经元与嗅系统特化化学感觉神经元间的发育关系尚不明晰，缺乏可区分这两类细胞群的可靠早期标志物。Goofy（Gfy）是高尔基体相关嗅信号调节因子，作为跨膜蛋白特异性表达于OE、VNO及GG的化学感觉神经元，研究人员利用Gfy1启动子驱动的123Cre小鼠进行遗传谱系示踪，旨在阐明Gfy表达谱是否涵盖OP所有衍生物（含迁移神经元），从而辨析嗅/犁鼻感觉神经元、GnRH-1神经元及TN神经元在发育上的谱系分野。该论文发表于《Developmental Dynamics》。

主要关键技术方法

研究人员使用Gfy(123)Cre小鼠（Cre重组酶敲入Gfy1启动子下游）与Rosa26^tdTomato（Ai14）报告小鼠交配获得GfyCre^+/-;Ai14^+/-胚胎及出生后动物进行谱系示踪；使用Prokr2Cre;Ai14示踪TN/先驱神经元作对照比较；通过E10.5/E11.5腹腔注射EdU进行出生标记（Birth-dating）并结合免疫荧光定量神经元发生与重组时差；采用RNAscope单分子荧光原位杂交检测Gfy mRNA在迁移GnRH-1神经元中的表达；利用E14.5鼻腔及出生后VNO已发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq，GEO: GSE234871、GSE247872、GSE252365）数据集分析Gfy在各类神经元簇的表达相关性；通过免疫荧光染色标记GnRH-1（抗GnRH-1抗体）、Map2（微管相关蛋白2，TN标记）、Peripherin（外周蛋白，神经纤维标记）、Somatostatin（Sst）、Gap43（生长相关蛋白43，未成熟神经元轴突标记）、Omp（嗅标记蛋白，成熟感觉神经元标记）、Meis2（顶侧V1R VSN标记）、Tfap2e/AP-2ε（底侧V2R VSN标记）等进行共定位分析；胚胎（E11.5–E18.5）及出生后（P30、P56）组织经固定、冰冻切片、免疫荧光及共聚焦成像后由FIJI/ImageJ定量。

研究结果

2.1 Gfy在发育中嗅系统新生神经元中呈异质性表达

研究人员分析E14.5鼻腔scRNA-seq数据，发现Gfy不表达于增殖性嗅/犁鼻祖细胞（Ascl1⁺、Mki67⁺）及刚退出细胞周期的前体（Neurog1⁺、Neurod1⁺），而与泛神经元标记Elav3（HuC）及未成熟神经元轴突标记Gap43呈强正相关，并与成熟嗅感觉神经元标记Omp共表达于假定化学感觉神经元簇；Prokr2⁺假定TN/先驱神经元簇仅有低水平Gfy表达，表明Gfy在OP来源的后有丝分裂成熟中/成熟神经元高表达，在迁移神经元中较弱。

2.2 GfyCre（123Cre）小鼠系可产生不同重组模式

GfyCre;Ai14后代出现两种重组表型——全身高度嵌合重组及仅限鼻腔化学感觉上皮的限定重组，本研究取后者分析。E11.5几乎无重组信号；E12.5–E13.5嗅上皮/VNO及与Peripherin⁺纤维关联的迁移细胞中出现稀疏tdTomato⁺细胞；E14.5–E15.5广泛重组见于OE、VNO及其向嗅球（Olfactory Bulb, OB）投射轴突、GG神经元；而向基底前脑延伸的Peripherin⁺TN纤维为tdTomato阴性。

2.3 发育过程中Gfy重组在神经元发生后24–48 h被检出

EdU在E10.5/E11.5注射后于E14.5检测，约60% EdU⁺早生化学感觉神经元呈tdTomato⁺，鼻腔迁移Gfy示踪神经元中50%为EdU⁺，表明GfyCre介导重组在神经元形成后约2–4天被检测到，存在时间延迟。

2.4 迁移期间Gfy不被迁移中GnRH-1神经元表达

RNAscope未在迁移GnRH-1神经元检出Gfy mRNA；E11.5–E15.5 GfyCre;Ai14胚胎中，GnRH-1神经元（抗GnRH-1免疫荧光标记）虽与Gfy示踪迁移细胞伴行，但无一例GnRH-1胞体被tdTomato标记，即便在GnRH-1发生（E10–E12）后追踪至E14.5（迁移完成前），均未见重组，说明发育期迁移GnRH-1神经元不表达或仅痕量表达Gfy，低于Cre激活阈值。

2.5 迁移完成后Gfy谱系示踪标记基底前脑部分GnRH-1神经元及额外OP来源神经元

E18.5及P56（成年）下丘脑视前区（Preoptic Area, POA）/正中隆起区，基底前脑出现三类细胞：①GnRH-1⁺tdTomato^-（~85%）；②GnRH-1⁺tdTomato⁺（E18.5为12±1.12%，P56为15±1.47%）；③tdTomato⁺GnRH-1^-非GnRH神经元（E18.5均值67±11.9个/截面，P56均值59±11.9个/截面）。提示迁移完成后少量GnRH-1神经元及额外OP来源神经元在脑内获得Gfy表达或发生迟发重组，暗示OP衍生前脑细胞具异质转录程序。

2.6 Gfy表达于Prokr2⁺TN/先驱神经元亚群

E14.5 GfyCre;Ai14与Map2（TN标记）共染可见部分Map2⁺迁移神经元为tdTomato⁺，证明Gfy标记TN/先驱神经元亚群而非全体。Somatostatin（Sst）⁺迁移细胞（源于VNO并加入迁移群）不为Gfy示踪但部分为Prokr2Cre示踪，说明Sst⁺迁移神经元属Prokr2谱系而不属Gfy谱系，进一步区分了迁移神经元内部亚群。

2.7 出生后Gfy表达提示V1R与V2R型VSN发育动力学的细微差异

重新分析出生后VNO scRNA-seq，Gfy重组发生于顶侧（Apical, Meis2⁺/V1R VSNs）与底侧（Basal, AP-2ε⁺/V2R VSNs）两系，但顶侧VSN较早较强共表达Gap43与Gfy，底侧VSN Gfy表达延迟且较弱；Rosa26位点基线表达在底侧VSN较低致报告信号偏弱。P30 GfyCre;Ai14组织免疫荧光验证：顶区VSN及前辅助嗅球（Anterior Accessory Olfactory Bulb, AOB）投射tdTomato强，底区VSN及后AOB（Posterior AOB）投射信号弱，证实GfyCre标记双系VSN但受谱系特异性报告敏感度影响。

讨论与结论总结（翻译浓缩）

关于嗅感觉神经元（OSNs）与鼻腔迁移神经元群的谱系关系长期存争议。本研究利用Gfy/123Cre谱系示踪发现：Gfy在E14.5富集于已分化嗅神经元及鼻腔内迁移神经元亚群（部分Prokr2⁺TN/先驱神经元），但不表达于发育期迁移中的GnRH-1神经元（RNAscope及E11.5–E14.5示踪均为阴性），证实GnRH-1神经元与嗅/犁鼻化学感觉神经元及多数TN神经元属不同遗传谱系。GfyCre重组较神经元发生延迟2–4天，EdU出生标记实验支持此点。值得注意的是迁移完成后（E18.5及P56）基底前脑出现~12–15% GnRH-1⁺tdTomato⁺细胞及非GnRH Gfy示踪细胞，提示存在异质GnRH神经元亚群或其他OP来源前脑细胞晚发表达Gfy。相较于Prokr2Cre标记广谱TN/先驱神经元，GfyCre只标记其中亚群，且Sst⁺迁移神经元属Prokr2谱系而不被Gfy标记。出生后VNO分析显示Gfy重组同时标记顶/底侧VSN但二者成熟动力学不同（顶侧更早更强），Rosa26报告敏感度差异致底侧信号偏弱。综上，Gfy是OP来源后有丝分裂神经元的共有分子特征之一，其差异表达水平可用于细化嗅系统谱系解析；研究结果支持多种OP衍生神经元群参与构成引导GnRH-1迁入前脑的迁移支架，并揭示脑内存在额外OP来源定植细胞。