《Aging Cell》：Nuclear Enlargement as a Histological Hallmark of Skeletal Muscle Aging, Revealed by Deep Learning-Driven Analysis and Validated in Inflammatory Myopathies
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衰老重塑人类骨骼肌的组织结构，但能够客观捕捉这一过程的细胞层面标志物仍然有限。研究人员将大规模组织学与深度学习相结合，以识别肌肉衰老的可重复性特征并验证其生物学相关性。研究人员采用双注意力卷积神经网络（DAM-CNN）及独立构建的Mask R-CNN模型，对来
衰老重塑人类骨骼肌的组织结构，但能够客观捕捉这一过程的细胞层面标志物仍然有限。研究人员将大规模组织学与深度学习相结合，以识别肌肉衰老的可重复性特征并验证其生物学相关性。研究人员采用双注意力卷积神经网络（DAM-CNN）及独立构建的Mask R-CNN模型，对来自人群资源的974张苏木精-伊红（H&E）染色全切片图像（WSI）进行分析，以量化细胞核大小与密度，并经人工复核验证。该分类器能够以高准确度区分年轻与衰老肌肉（AUC 0.91；准确率86.2%），且注意力图一致性地将核增大与空间结构紊乱凸显为显著特征。核直径随年龄增长而增加（Spearman's ρ = 0.71, p < 0.0001），该结果在自动化测量与人工测量中均得到验证。与之一一对应的转录组学分析显示，具有较大细胞核的样本在染色质重塑、蛋白质稳态、细胞衰老、线粒体活性及端粒调控相关通路中呈现富集，而较小细胞核则与抗炎及DNA修复程序相关。外部验证的儿科炎性肌病患者表现出与衰老肌肉相当的核增大现象，提示炎症相关的提早组织学衰老。这些发现将核增大的定确定为整合骨骼肌衰老结构与分子特征的可靠、可量化标志特征。研究人员提出的深度学习核形态计量学为细胞层面的衰老生物标志物提供了可扩展的分析框架，并提示了一种适用于生理性衰老与疾病状态的潜在"肌肉衰老时钟"。
骨骼肌衰老表现为进行性结构与功能衰退，临床上以肌少症（sarcopenia）、活动能力下降及衰弱增加为特征，严重影响老年人群的生活质量。在组织与细胞层面，衰老骨骼肌呈现肌纤维萎缩、纤维化增加、慢性炎症（即炎性衰老，inflammaging）、肌核组织改变及再生能力受损等标志性特征。近年来，研究日益强调细胞核是衰老相关重塑的关键位点；然而，关于核大小的观察结果在文献中并不一致，部分原因在于物种差异或成像方法学的不同。传统组织学研究主要依赖人工评估，存在劳动密集、易受观察者偏倚影响及难以捕捉组织结构复杂性等局限。因此，自动化、高通量且无偏倚地表征衰老相关形态特征，特别是在细胞核层面，仍存在显著空白。人工智能（AI）尤其是卷积神经网络（CNN）等深度学习技术的发展，为系统克服传统组织学分析的局限性提供了契机，但此类方法在人类骨骼肌中的应用仍相对有限。
本研究旨在建立基于深度学习的整合分析流程，以实现骨骼肌组织学衰老特征的高通量、无偏倚分析。研究人员基于GTEx（Genotype-Tissue Expression）数据库的大规模H&E染色肌肉图像，开发并验证了双注意力模块卷积神经网络（DAM-CNN），用于自动检测衰老相关形态变化；同时系统量化了核改变，特别是核增大这一已知的细胞衰老形态学标志特征，并通过自动化分割与人工验证方法确保准确性与可重复性。此外，研究人员将组织学数据与匹配的转录组学谱整合，以全面探索与衰老相关核改变关联的分子通路。研究人员进一步通过分析儿科炎性肌病患者的肌肉活检样本验证了研究发现的临床与转化相关性，这些疾病以肌肉萎缩、变性和慢性炎症为特征；在此类患者中观察到的提早核增大揭示了疾病相关肌肉重塑与生理性衰老之间的共享形态学特征。
该研究发表于《Aging Cell》。研究人员采用的关键技术方法包括：基于GTEx数据库974张H&E染色全切片图像（WSI）的大规模组织学分析，样本来源为20至70余岁供体的腓肠肌组织；外部验证采用越南国家儿童医院（VNCH）2018年至2024年间收集的60例儿科患者存档骨骼肌组织学样本，包括组织学正常组织、非特异性炎症及幼年型皮肌炎（JDM）/幼年型多发性肌炎（JPM）组；深度学习方面，以ResNet34为骨干网络构建DAM-CNN进行年龄分类，采用Grad-CAM进行可解释性AI可视化；核实例分割与量化采用基于Detectron2框架、以NuInsSeg数据集预训练的Mask R-CNN模型，ResNet-50结合特征金字塔网络（FPN）增强多尺度特征提取；核形态手动验证在无异物区进行，包括H&E颜色反卷积与颗粒分析；转录组学分析采用GTEx骨骼肌RNA测序数据，按核平均直径将供者分层，选取最大与最小核直径的各2.5%样本（各20例）进行差异基因表达分析与基因集富集分析（GSEA）。
**基于深度学习的整合框架发现骨骼肌衰老相关组织学特征**
研究人员建立了深度学习分析流程，结合大规模组织学图像处理与转录组学验证。从GTEx项目获取974张H&E染色WSI及供体年龄信息，经倾斜校正、高信息含量图像块提取、低信息区域过滤及标准化处理后，进入两条并行互补路径：DAM-CNN用于肌肉形态分类与衰老相关组织学特征可视化；Mask R-CNN用于核大小与密度等特征的量化分割，并以人工测量验证。为评估生物学相关性，匹配GTEx样本的转录组学分析揭示了形态改变与基因表达模式之间的显著关联。外部验证采用越南国家儿童医院的儿科肌营养不良症患者肌肉活检样本，一致的核增大现象强化了其作为病理性与衰老相关性肌肉萎缩可重复组织学标志的作用。
**DAM-CNN识别骨骼肌衰老相关核改变**
研究人员将DAM-CNN应用于标准化骨骼肌图像块，该网络以ResNet34为骨干，每个残差块集成通道注意力与空间注意力机制，增强模型检测细微衰老相关组织学模式的能力。数据集按80%训练-验证集与20%测试集随机划分，训练-验证集采用五折交叉验证。二元分类任务区分年轻与衰老肌肉样本，结果显示灵敏度82.66%±1.53%、特异度88.72%±1.47%、准确率86.15%±4.85%，AUC达0.91。通过Grad-CAM提取的注意力特征图显示，模型高度关注区域常对应核增大或不规则核分布区域，支持这些特征与骨骼肌衰老相关结构变化的关联。
**基于深度学习的形态计量学定量评估衰老相关核改变**
为验证DAM-CNN识别的组织学改变，研究人员构建了高通量核特征深度学习形态计量学分析流程。基于Detectron2框架的Mask R-CNN模型训练于NuInsSeg数据集，采用ResNet-50结合FPN增强多尺度特征提取。该模型在紧凑区与纤维化区均能有效检测细胞核，定性检视确认核识别未受背景染色或组织伪影干扰。分析显示，核直径分布随年龄呈现明显偏移：年轻样本富集2-8 μm小直径核，而衰老样本向右偏移至12-18 μm范围；各年龄组间核平均直径呈强正相关（R2 = 0.5, p < 0.0001；Spearman's ρ = 0.71），表明核增大是衰老的连续且显著的组织学特征。核数量与年龄虽存在统计学关联（R2 = 0.02, ρ = 0.1, p < 0.0001），但相关性较弱；第五十年代核数量短暂增加，60岁以上则下降，可能反映中年期代偿性肌核招募，随后晚期再生衰竭。
**基于无异物区人工测量的核形态计量学验证**
为减轻衰老骨骼肌中脂肪浸润或纤维化可能引入的伪影，研究人员在无异物区域进行手动核形态计量学分析，包括区域选择、图像预处理、H&E颜色反卷积及基于颗粒的核检测。结果显示，从20岁至60岁以上年龄组，核平均直径呈进行性增加（R2 = 0.163, Spearman's ρ = 0.38, p < 0.0001），与自动化发现方向一致；核数量亦随年龄逐渐增加（R2 = 0.158, ρ = 0.20, p < 0.0001），总体模式与自动化流程平行。这些手动筛选结果佐证了深度学习分割的可靠性，确认核增大是可重复、可量化的衰老骨骼肌特征。
**转录组富集分析验证核大小在肌肉衰老中的功能相关性**
为确定核大小是否反映生物学意义的衰老过程而非随机形态变异，研究人员按WSI量化的平均核直径对GTEx骨骼肌转录组进行GSEA比较，选取最大与最小核直径的各2.5%样本（各20例）。富集基因集按功能分为八大类：核功能、增殖、蛋白质稳态、线粒体活性、肌肉维持、端粒调控、抗炎及DNA修复。其中核结构与增殖相关通路最为突出，分别占所有富集基因集的39.5%和24.9%。基因集互作网络显示，核相关与蛋白质稳态通路及衰老相关转录程序形成紧密连接模块，提示核增大与肌肉衰老更广泛的转录组重塑同步发生。代表性基因集热图分析揭示，核结构、蛋白质稳态、线粒体功能、DNA修复及抗炎反应的代表性基因在较小核样本中表达上调，表明较小核肌肉维持着涵盖稳态与应激响应的转录活跃状态；而较大核样本中这些通路表达相对降低，提示与衰老或衰老样状态相关的协调转录活动下降。相关性网络分析进一步显示，大核样本中基因-基因关联紧密，尤其核结构、蛋白质稳态与增殖相关基因间，而小核样本中关联稀疏且组织性较差。
**核增大作为儿科炎性肌病提早衰老标志**
研究人员假设JDM和JPM患者可能表现出以大核为特征的提早衰老表型。将核形态计量学流程应用于越南国家儿童医院儿科患者诊断性肌肉活检标本，样本分为组织学正常组、非特异性炎症组及JDM/JPM组。结果显示，炎症组和JDM/JPM组的核直径均显著高于正常对照（p < 0.0001），核数量亦显著增加（p < 0.0001），提示炎症和自身免疫性肌病中核增大是病理肌肉重塑的共同特征。核直径与年龄呈显著正相关（y = 0.234x + 6.06），许多JDM/JPM样本的核大小超过年龄匹配对照，达到成人GTEx供体水平。应用核特征预测模型评估，JDM/JPM组样本倾向于聚于等值线上方，表明从核形态推断的生物学年龄高于实际年龄，与组织层面提早衰老一致。代表性组织学图像显示，JDM/JPM和炎症组肌肉呈现纤维紊乱、核中心化及核聚集增加，与炎症损伤和衰老相关肌肉退行性变一致。
在讨论部分，研究人员指出核增大是肌肉衰老的突出形态学标志，而非衰老的特异性或排他性标志，反映的是可靠的组织层面衰老相关改变指标。转录组学分析显示，较小核样本中核膜组织、染色质重塑、蛋白质稳态、衰老、抗炎反应和DNA修复相关基因集一致富集，提示核形态反映衰老肌肉组织中潜在的分子重塑。然而，这些转录组特征可能反映细胞内在改变与细胞组成变化（如纤维化或免疫细胞浸润增加）的共同作用，未来需结合免疫组化或空间转录组学进一步解析。细胞衰老是复杂且依赖情境的过程，体外证据表明衰老细胞常表现细胞体积增大、核增大及核建筑改变，但体内尤其在结构受限的组织如骨骼肌中，全局细胞增大可能被邻近细胞和基质成分掩盖，而核形态在组织中仍易于观察和量化。儿科JDM和JPM患者肌肉活检中出现的与成年衰老者相当的核增大，提示炎性肌病可能加速通常随衰老出现的核重塑过程，但这种重叠反映的是疾病相关重塑与衰老样机制的共同之处，而非与生理性衰老直接等同。驱动核增大的机制尚待充分阐明，候选通路包括DNA损伤反应、染色质重组及核选择性自噬（nucleophagy）受损等。
研究结论部分指出：核增大是骨骼肌衰老的可靠且可量化的组织学特征，与炎症、细胞应激和组织退化相关的潜在转录和结构改变相关联。利用深度学习驱动的核形态计量学方法，研究人员证实核大小与年龄和疾病进展密切相关，并能在生理性衰老和病性肌肉状态中介导衰老相关改变。这些结果提示核形态计量学有潜力作为组织学指标或预测性度量，用于识别生理和病理背景下的提早衰老样表型。儿科炎性肌病中提早核增大的观察进一步支持疾病相关重塑与衰老相关过程之间存在重叠机制的可能性。此外，鉴于核增大与衰老相关特征的先验关联，研究结果提示受损的核清除机制可能促进衰老肌肉中的核改变，为未来机理研究和靶向肌肉衰老及相关疾病中核重塑的治疗策略指明了重要方向。
