《Methods》：An automated workflow for quantifying the formation of synuclein aggregates in human dopaminergic neurons
编辑推荐：
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种神经退行性疾病，其特征在于α-突触核蛋白（α-syn）聚集体，称为路易小体（Lewy bodies）。为了在体外模拟PD病理，α-syn预形成纤维（preformed fibrils, PFFs）
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种神经退行性疾病，其特征在于α-突触核蛋白（α-syn）聚集体，称为路易小体（Lewy bodies）。为了在体外模拟PD病理，α-syn预形成纤维（preformed fibrils, PFFs）可被细胞摄取，作为种子驱动内源性α-syn的错误折叠和聚集，新的聚集体放大这一过程。将PFFs外源施加于多巴胺能神经元（dopaminergic neurons, DNs）可增加聚集体形成，以α-syn在丝氨酸129（serine 129）位点的磷酸化（pS129-syn）为标志，这是一种PD病理标志物。基于此，研究人员开发了一种自动化突触核蛋白播种测定法（automated synuclein seeding assay），以量化iPSC来源的DNs中新的α-syn聚集体。利用pS129-syn作为读出指标，研究人员发现PFFs引起pS129-syn聚集体的时间和剂量依赖性增加。该自动化播种测定进一步揭示聚集体的形成依赖于内源性α-syn水平。与来自同一位点的等基因iPSC系（其中SNCA基因突变已通过CRISPR/Cas9校正）的DNs相比，PFFs处理在来自SNCA基因三倍体（编码α-syn蛋白并升高总α-syn水平）的PD患者的iPSC DNs中引起pS129-syn聚集体的更大增加。相反，在所有SNCA基因拷贝被敲除（knocked out, KO）的神经元中未检测到pS129-syn信号。这种用于突触核蛋白播种的原理验证自动化高内涵成像工作流程已在具有确定SNCA拷贝数变异的等基因细胞系中得到验证，并为评估可能阻碍α-syn聚集体形成的化合物和治疗方法提供了一个平台。
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种以多巴胺能神经元（dopaminergic neurons, DNs）进行性丧失和由α-突触核蛋白（α-syn）组成的路易小体（Lewy bodies, LBs）累积为特征的神经退行性疾病。α-syn在病理条件下可错误折叠形成寡聚体和纤维结构，进而招募内源性α-syn形成细胞内聚集体，同时伴随翻译后修饰（posttranslational modifications, PTMs），尤其丝氨酸129位点磷酸化（pS129-syn）是PD的关键病理标志。目前，基于α-syn预形成纤维（preformed fibrils, PFFs）的细胞模型可模拟这一过程，但缺乏可扩展、自动化的高通量方法用于定量人源DNs中α-syn聚集体的形成。为此，研究人员利用携带SNCA基因三倍体（SNCA Tri）突变的PD患者iPSC系及其等基因对照（Isog Ctrl）和所有拷贝敲除（SNCA KO）系，开发了一种自动化突触核蛋白播种测定法（automated synuclein seeding assay），以pS129-syn为读出指标，通过高内涵成像和神经元分析管道量化PFFs诱导的α-syn聚集体形成。该研究证实PFFs以时间和剂量依赖性方式诱导聚集体形成，且依赖于内源性α-syn水平；SNCA Tri DNs较Isog Ctrl DNs对PFFs更敏感，而SNCA KO DNs无信号。该自动化工作流程在具有确定SNCA拷贝数变异的等基因细胞系中得到验证，为评估抑制α-syn聚集的化合物提供了平台。相关论文发表在《Methods》上。
研究人员为开展研究使用了以下关键技术方法：从PD患者（SNCA Tri）及其等基因校正系（Isog Ctrl）和SNCA KO系的iPSC分化出腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞（DA NPCs）及DNs，采用单层分化法；α-syn PFFs由重组单体α-syn经震荡组装并超声制备，通过动态光散射（DLS）和电子显微镜（EM）进行质量控制；PFFs处理两周后，对DNs进行免疫荧光（IF）染色，检测pS129-syn、TUBB3、泛素（Ub）、p62及细胞器标志物；高内涵成像在CellInsight CX7平台上自动采集图像，并利用神经元分析管道（包括细胞体识别、神经突起识别和斑点识别模块）量化pS129-syn斑点总荧光强度，归一化至神经突起总长度作为α-syn聚集体形成的读出指标。
研究结果分为四个部分：
1. **从携带SNCA三倍体突变的患者来源iPSC中脑多巴胺神经元的特征鉴定**：通过对SNCA Tri、Isog Ctrl和SNCA KO iPSC产生的DA NPCs和两周分化的DNs进行免疫荧光和qPCR分析，确认三种细胞系均表达中脑DNs标志物（如TH、FOXA2、Nurr1、GIRK2等），无显著差异；蛋白质印迹显示SNCA Tri DNs中α-syn蛋白水平显著高于Isog Ctrl，而SNCA KO中检测不到α-syn。这证实了成功生成具有不同α-syn水平的等基因DNs。
2. **α-syn PFFs在iPSC来源的多巴胺神经元中诱导磷酸化突触核蛋白聚集体形成**：将PFFs（500 nM）加入两周分化的DNs中，两周后免疫荧光显示SNCA Tri和Isog Ctrl DNs中出现pS129-syn阳性聚集体，SNCA Tri信号更强，而SNCA KO中无信号。高倍共聚焦分析显示，pS129-syn阳性聚集体在神经突起中呈纤维状，在细胞核周围形成致密包涵体，并共定位UB和p62（LBs标志物），且包含溶酶体（LAMP1）、线粒体（TOM20）和高尔基体（GM130）等细胞器标志物，表明这些聚集体具有与脑内LBs相似的生化特征。
3. **原理验证的自动化高内涵成像与分析α-突触核蛋白聚集体形成**：在96孔板中建立可扩展的高内涵成像流程，自动获取TUBB3和pS129-syn图像，并通过神经元分析管道创建神经突起掩膜，在掩膜内检测pS129-syn斑点。结果显示，PFFs处理组pS129-syn信号显著高于单体处理组，且信号随PFFs浓度升高（0–1000 nM）而增加；λ磷酸酶处理可消除信号，证实抗体特异性识别磷酸化α-syn。该流程能够自动、特异性地检测和定量pS129-syn信号。
4. **PD患者和对照多巴胺神经元中α-突触核蛋白聚集体形成与化合物测试**：在SNCA Tri和Isog Ctrl DNs中，PFFs以浓度依赖性方式诱导聚集体形成，SNCA Tri DNs需要250 nM PFFs即可显著增加，而Isog Ctrl需要500 nM；时间分析显示SNCA Tri DNs在7天即可出现信号，而Isog Ctrl在14天才有显著信号，SNCA KO始终无信号。作为原理验证，研究人员测试了七种已知影响α-syn聚集的化合物（包括myricetin、resveratrol、baicalin等）。在500 nM PFFs条件下，resveratrol显著降低pS129-syn信号，myricetin有降低趋势但未达统计学显著；剂量响应实验显示myricetin和resveratrol均以剂量依赖性方式减少聚集体形成，且在较低剂量下（myricetin 12.5–25 μM，resveratrol 6.25–50 μM）不影响细胞活力（存活率>85%）。
讨论部分总结：研究人员首次报道了一种可扩展的筛查工作流程，用于监测人DNs中α-syn聚集体的形成。该研究利用等基因细胞系证实PFFs诱导的聚集体依赖于内源性α-syn水平，且pS129-syn是有效的读出指标。聚集体与LBs标志物（Ub、p62）及细胞器共定位，重现患者脑内特征。自动化高内涵成像流程可检测时间、剂量依赖性聚集，并成功识别resveratrol和myricetin作为候选抑制剂。研究局限性包括：未计算Z′因子和板间变异；仅关注单一细胞类型，未涉及胶质细胞；未在现有条件下观察到DN变性。未来可将该assay扩展到共培养系统，并研究其他α-syn PTMs。
研究结论翻译：综上所述，研究人员开发了一种原理验证的自动化α-syn播种测定法，用于量化来自PD患者的hiPSC来源DNs中α-syn聚集体的程度。该α-syn播种测定法可用于测试化合物抑制或减少α-syn聚集的能力，且该工作流程可轻松适用于后续研究中其他PTMs或其他突触核蛋白病相关细胞类型的研究。
