结合PCR和宏基因组学方法揭示柬埔寨家畜和伴侣动物中采集的蜱虫携带的蜱传病原体

《Pathogens》：Combining PCR and Metagenomic Approaches to Reveal Tick-Borne Pathogens in Ticks Collected from Livestock and Companion Animals in Cambodia

　　

在柬埔寨，家畜生产在国民经济和粮食安全中发挥着重要作用，然而蜱传疾病（tick-borne diseases, TBDs）仍是动物健康和生产力的一个未被充分认识的制约因素。在这个以农村为主的背景下，家养动物也可能作为人畜共患病原体的储存宿主。为解决柬埔寨蜱传病原体缺乏基线分子数据的问题，研究人员开展了一项横断面研究，收集了2022年11月至2023年4月期间来自24个省份的蜱虫。蜱虫采集自多种宿主和环境，包括猫、牛、狗、山羊、穿山甲、蟒蛇、野猪以及蝙蝠洞穴地面，代表了城市、农村、农场、野生动物救援中心和森林边缘栖息地。共有1526只属于9个物种的蜱虫被合并为352个样本，并使用常规PCR（conventional PCR, cPCR）进行筛查，靶向无形体属（Anaplasma）、埃立克体属（Ehrlichia）、巴贝斯虫属（Babesia）和考克斯体属（Coxiella）。此外，对部分微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）进行了宏转录组二代测序（next-generation sequencing, NGS）分析。从牛身上采集的微小扇头蜱检测出边缘无形体（Anaplasma marginale）（占池的1.1%）和米纳森埃立克体（Ehrlichia minasensis）（占池的0.9%），而从狗身上采集的林奈扇头蜱（Rhipicephalus linnaei）检测出扁平无形体（Anaplasma platys）（占池的0.3%）和犬巴贝斯虫（Babesia canis）（占池的2.0%）。在来自牛和山羊的微小扇头蜱中发现了高流行率的考克斯体样内共生菌（Coxiella-like endosymbionts）（占池的15.6%）。宏转录组分析还在来自牛的微小扇头蜱中鉴定出六种蜱相关病毒；其中广东蜱马利病毒（Guangdong tick manly virus）最为优势（占样本的32.5%），其次是漳州Totiv蜱病毒1（Zhangzhou Totiv tick virus 1）（15.0%）、荆门蜱病毒（Jingmen tick virus）（5.0%），以及Mogiana蜱病毒、扇头蜱相关弹状样病毒和扇头蜱相关黄病毒样病毒，各占2.5%。这些发现首次提供了分子证据，表明柬埔寨的微小扇头蜱和林奈扇头蜱中循环着多种细菌、原虫和病毒病原体。该研究强调了需要整合“One Health”监测，以更好地理解、预防和控制该地区的蜱传疾病。

论文解读文章

**研究背景与问题**
柬埔寨的家畜生产对国民经济和粮食安全至关重要，但蜱传疾病（tick-borne diseases, TBDs）对动物健康和生产力的制约长期被忽视。该国以农村为主的环境使家养动物可能成为人畜共患病原体的储存宿主，然而缺乏直接的系统性监测数据，导致对病原体多样性、分布及影响的认知严重不足。现有知识多依赖区域研究的推断，亟需针对柬埔寨本土蜱种群中病原体循环的基线分子数据。为此，研究人员在《Pathogens》期刊发表论文，旨在通过互补的分子方法建立全面的蜱相关微生物基线概览，并评估未来进行宏基因组监测的可行性。

**研究内容与结论**
研究人员于2022年11月至2023年4月在柬埔寨24省开展横断面调查，从牛、狗、猫、山羊、穿山甲、蟒蛇、野猪及蝙蝠洞穴环境采集蜱虫，共获得1526只（9个物种），合并为352个池样本。采用常规PCR（cPCR）靶向检测无形体属（Anaplasma）、埃立克体属（Ehrlichia）、巴贝斯虫属（Babesia）和考克斯体属（Coxiella），并对部分微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）进行宏转录组二代测序（NGS）以探索病毒多样性。结果表明：总池阳性率为44.0%，其中考克斯体样内共生菌（Coxiella-like endosymbionts, CLE）最普遍（15.6%），其次为无形体属（13.3%）、考克斯体属（8.2%）和巴贝斯虫属（2.0%）。牛源的微小扇头蜱检出边缘无形体（Anaplasma marginale, 1.1%）和米纳森埃立克体（Ehrlichia minasensis, 0.9%）；狗源的林奈扇头蜱（Rhipicephalus linnaei）检出扁平无形体（Anaplasma platys, 0.3%）和犬巴贝斯虫（Babesia canis, 2.0%）。宏转录组分析在40只微小扇头蜱中检出6种蜱相关病毒，以广东蜱马利病毒（Guangdong tick manly virus, GTMV）最优势（32.5%），其次为漳州Totiv蜱病毒1（15.0%）、荆门蜱病毒（Jingmen tick virus, JMTV, 5.0%）等。系统发育分析确认了病原体的遗传亲缘关系，其中来自Preah Sihanouk牛源的巴贝斯虫属未知种显示出独特进化分支。这些发现首次提供了柬埔寨微小扇头蜱和林奈扇头蜱中多种细菌、原虫和病毒循环的分子证据，强调了“One Health”综合监测的必要性。

**主要关键技术与方法**（不超过250字）
样本队列来源：2022年11月至2023年4月从柬埔寨24省采集，涵盖牛、狗、猫、山羊等家畜及伴侣动物，以及穿山甲、蟒蛇、野猪等野生动物和蝙蝠洞穴环境。关键技术包括：① 常规PCR（cPCR）靶向16^S rRNA基因（Anaplasma、Ehrlichia、Coxiella）和18^S rRNA基因（Babesia）进行病原筛查，阳性样本经Sanger测序确认；② 对其中40只微小扇头蜱个体进行宏转录组二代测序（NGS），通过RNA提取、核糖体RNA去除、反转录建库后测序，生物信息学分析鉴定病毒序列并计算丰度（reads per million, RPM）。统计采用池阳性率和最小感染率（minimum infection rate, MIR）估计流行率。

**研究结果**

**3.1 PCR结果**
共筛查352个蜱池，135个池（38.4%）至少检出一种病原体。单病原体检测占85.93%（116/155），双病原体占13.33%（18/155），三病原体仅0.74%（1/155）。牛源微小扇头蜱的检出贡献最大（占全部检测的33.8%），其次为狗源林奈扇头蜱（9.3%）。CLE在15.6%的池中检出，A. marginale为1.1%，E. minasensis为0.9%，B. canis为0.3%。最小感染率（MIR）显示49.4%的个体蜱（753/1526）至少感染一种病原体，CLE的MIR最高（18.1%）。

**3.2 DNA测序与系统发育分析**
基于16^S rRNA的系统发育树显示，A. marginale菌株与印度参考株（OP851751.1）相似性>99%；A. platys与赞比亚株（LC269820.1）相似性99.68%；E. minasensis与中国株（PQ896500.1）相似性>99%。基于18^S rRNA的分析确认B. canis属于犬巴贝斯虫复合群，但无法区分子种（如B. canis vogeli）。牛源微小扇头蜱中检出的巴贝斯虫属未知种与已知序列无高置信度匹配，提示潜在新谱系。所有55条CLE序列与南非R. sanguineus的考克斯体内共生菌（PQ508355.1）相似性>99%。

**3.3 微小扇头蜱中病毒检测**
宏转录组分析显示18/40只（45%）微小扇头蜱RNA阳性，检出6种病毒：GTMV（12只，32.5%）、漳州Totiv蜱病毒1（6只，15.0%）、JMTV（2只，5.0%）、Mogiana蜱病毒（1只，2.5%）、扇头蜱相关弹状样病毒（1只，2.5%）和扇头蜱相关黄病毒样病毒（1只，2.5%）。单病毒感染占35%，双感染占7.5%，四重感染占2.5%。GTMV在Battambang、Oddar Meanchey等4省发现，以雄蜱为主。

**3.4 病毒丰度与基因组覆盖度**
共获得2.589亿条测序读数。GTMV在Battambang一雄蜱中占RNA的20.6%（约20.58万RPM），基因组覆盖度99-100%，核苷酸相似性约96%。漳州Totiv蜱病毒1的RPM范围1880-9360，覆盖度98-100%。JMTV的RPM范围1403-216265，覆盖度90-97%。其余病毒均显示近完整或完整基因组覆盖度（97-100%），核苷酸相似性93-95%。

**讨论与结论**
讨论指出，A. marginale和E. minasensis的检出率与越南、泰国等区域数据相当，而A. platys和B. canis的流行率低于泰国。牛源微小扇头蜱中未检出Coxiella burnetii，但CLE高流行，后者虽非致病性，但可影响蜱生物学特性。JMTV的检出具有重要公共卫生意义，因其可感染人类并引起发热，但本研究仅检测到RNA，不能确认病毒复制或传播能力，需进一步分离和血清学调查。研究局限性包括横断面设计无法捕捉时间动态、池样本限制个体流行率计算、缺乏动物和人类血清学数据。结论部分翻译如下：
该研究提供了基础分子证据，表明对兽医和潜在人畜共患关切具有重要意义的蜱传病原体存在于柬埔寨。为了更好地理解传播途径、评估对家畜的经济影响以及评估潜在公共卫生风险，亟需扩展整合的“One Health”监测。该方法应结合蜱鉴定、病原体检测和宿主水平诊断。未来将纵向昆虫学采样、宿主血清学和临床诊断相结合的研究，将更全面地理解柬埔寨蜱传疾病的生态学。