综述：用于胶质母细胞瘤分泌组生物标志物筛选的MALDI-TOF质谱技术：挑战与前景综述

《Current Issues in Molecular Biology》：MALDI-TOF Mass Spectrometry for Glioblastoma Secretome Biomarker Screening: A Review of Challenges and Perspectives

　　

胶质母细胞瘤（GBM）仍是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其特征为高度异质性和不良预后。尽管基因组学和转录组学分析提供了结构上的见解，但它们往往未能捕捉肿瘤微环境（TME）内的动态相互作用。分泌组分析——研究肿瘤细胞主动分泌的蛋白质——提供了这些相互作用的功能性读数，并成为潜在生物标志物的储备库。在本综述中，研究人员批判性地评估了MALDI-TOF质谱（MALDI-TOF MS）作为GBM分泌组分析策略工具的作用。虽然液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）仍是深度蛋白质发现的金标准，但研究人员认为，MALDI-TOF MS的速度、成本效益和高通量能力使其成为临床筛选和“光谱表型分析”的理想平台。研究人员讨论了技术障碍，如离子抑制和“泄露组”（leakome）（细胞内污染），并强调了将MALDI与细胞外囊泡（EV）富集和人工智能（AI）相结合如何能够弥合体外发现与临床应用之间的差距。

1. 引言
癌症分泌组分析，包括胶质母细胞瘤（GBM），日益重要。它允许多个研究人员在分子水平上理解癌细胞与肿瘤微环境之间的通信。分泌组分析涉及鉴定和量化细胞释放的蛋白质及其他因子。在GBM背景下，质谱（MS）技术，如基质辅助激光解吸/电离（MALDI），能够对细胞培养基中的蛋白质进行图谱绘制。这种图谱揭示了不同侵袭性、侵袭潜能或治疗反应细胞系之间分泌谱的差异。例如，无标记定量质谱已揭示组蛋白去乙酰化酶（iHDAC）抑制剂可通过特异性重塑“血管生成基质体”——调节核心蛋白聚糖（decorin）和ADAM家族蛋白酶（ADAM10, 12, 15）等因子——来调节肿瘤行为，而非通过直接抑制血管内皮生长因子（VEGF）。这突出了一个关键的机制联系：组蛋白翻译后修饰（PTMs）调节染色质结构以驱动肿瘤进展，而靶向相关酶（如去乙酰化酶或甲基转移酶）是一种快速发展的治疗策略。分泌组分析作为这种表观遗传状态的功能性读数，使多个研究人员能够监测表观遗传疗法如何重塑肿瘤微环境。该方法能够识别候选生物标志物，更重要的是，帮助研究人员理解治疗性变化如何影响细胞分泌，进而影响微环境重塑、血管生成、侵袭和免疫反应。简言之，分泌组分析是一种将细胞机制基础研究与生物标志物和治疗靶点搜索相结合的工具。该方法允许识别候选生物标志物，但更重要的是，它提供了对治疗耐药和复发机制的见解，这是GBM管理中的主要临床挑战。例如，理解替莫唑胺（TMZ）耐药细胞的分子变化对于识别新的治疗靶点至关重要。最近利用基因表达谱的计算研究已成功识别出BMS345541——一种靶向FOXG1转录因子的药物——作为逆转TMZ耐药的潜在重定位药物。在此背景下应用分泌组分析，同样可能揭示此类耐药通路的细胞外效应因子，从而超越单纯描述，迈向潜在的功能干预。虽然液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）因其高灵敏度仍是深度蛋白质发现的金标准，但MALDI-TOF MS为临床分泌组筛选提供了独特优势。首先，MALDI-TOF MS提供了无与伦比的通量和成本效益，能够在LC-MS/MS所需时间的一小部分内分析数百个样本。此外，MALDI-TOF MS在低分子量范围（肽组学）特别有效，捕获了在鸟枪法蛋白质组学的广泛分级或酶解步骤中经常丢失的生物活性肽片段（<10 kDa）。这允许生成“光谱指纹”——快速、诊断性的分子特征，可用于临床环境中实时监测肿瘤进展和治疗反应。在本综述中，研究人员评估了MALDI-TOF MS在GBM分泌组分析中的潜力，讨论了技术限制、临床转化挑战和未来前景。

2. 胶质母细胞瘤病理生理学与研究模型
胶质母细胞瘤（GBM）的特征在于其深度的瘤内和瘤间异质性，体现在基因组、转录组和表观遗传学层面。尽管临床管理依赖于分子分型——包括评估异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变（作为主要诊断和预后指标）和O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）启动子甲基化（烷化剂化疗敏感性的关键预测因子）——以及转录分类（前神经型、间充质型、经典型），这些静态标记往往未能捕捉肿瘤进展的动态性质。主要的临床“痛点”——对替莫唑胺（TMZ）的耐药和不可避免的复发——是由一组主动重塑其微环境的细胞驱动的。在此背景下，分泌组充当了一个关键的功能界面；肿瘤细胞调节细胞外空间以促进侵袭、血管生成和免疫逃逸。因此，分析分泌因子是理解GBM克隆如何适应治疗并绕过血脑屏障限制的必要条件。最近对整个蛋白质组数据集的荟萃分析已确定GBM中一组核心失调蛋白，包括与正常脑组织相比154种常见上调和116种下调因子。这些变化反映了mRNA剪接和免疫系统通路的关键改变，为必须解释作为这些变化功能性读数的分泌组提供了系统背景。体外模型是MALDI基分泌组学的基本发现平台，提供了高通量方法优化所需的高重现性和简化样本制备。这些受控系统允许在特定应激源（如表观遗传调节或药物暴露）下精确绘制分泌组变化，而无需考虑体内环境固有的系统噪声。然而，传统2D培养的转化实用性受限于缺乏胶质母细胞瘤微环境的架构复杂性、氧气梯度和多细胞相互作用（例如与免疫细胞和内皮细胞），这可能导致长期传代后原始肿瘤特征的丢失。因此，虽然GBM细胞系对于分泌组特征的初始高通量筛选和MALDI-TOF MS工作流程的开发不可或缺，但它们必须被视为基础步骤。在更复杂的患者来源3D模型（类器官）和纵向临床样本中验证这些体外“指纹”对于确保生物学相关性和临床适用性是强制性的。从孤立细胞系分泌组到“区域蛋白质组”（直接从肿瘤边缘分析蛋白质）的转变是必要的下一步。细胞系作为一个发现平台，其中MALDI特征首先在简化条件下被识别，然后针对临床样本的“噪声”背景进行验证。

3. 分泌组作为诊断和功能枢纽
癌症分泌组作为一个动态信号枢纽，控制着GBM细胞与肿瘤微环境（TME）之间的复杂交互。与全细胞蛋白质组学不同，分泌组分析提供了主动介导微环境重塑的因子（如蛋白酶、细胞因子和细胞外囊泡（EV））的直接读数，这些因子在血浆和脑脊液（CSF）等临床生物体液中具有潜在可检测性。区分可溶性分泌组组分与EV相关货物至关重要，因为它们需要不同的分离工作流程（例如超滤与超速离心）。此外，虽然可溶性蛋白质通常被直接分析，但EVs需要一个特定的裂解步骤以释放封装的蛋白质，从而实现有效的MALDI-TOF MS检测。在GBM中，这些分泌因子是侵袭性生长的主要决定因素。具体来说，细胞外空间中金属蛋白酶和粘附因子的富集有助于区分高侵袭性与低侵袭性细胞表型。此外，分泌组分和外泌体货物作为旁分泌效应因子，重编程周围的小胶质细胞和免疫细胞，培养一个促进肿瘤进展和逃逸的免疫抑制环境。然而，鉴定一个分泌蛋白仅仅是产生假设的步骤。为了向临床实用性迈进，这些发现必须经过严格的功能验证，将候选标志物与核心致癌驱动因子（如PI3K/AKT信号轴）或已建立的TMZ耐药机制联系起来。在胶质母细胞瘤中，EGFR扩增或PTEN缺失下游的致癌性PI3K/AKT/mTOR信号不仅支持增殖和治疗耐药，还通过增加VEGF表达和分泌来增强血管生成输出，从而将分泌组重塑为促血管生成表型。同时，组成性激活的NF-κB在GBM细胞中协调慢性炎症程序，其中TNF-α驱动的NF-κB激活诱导强效IL-6产生，维持STAT3信号，并促进其他炎症介质的表达，共同培养一个富含促炎细胞因子的免疫抑制、肿瘤支持性微环境。此外，恶性细胞表现出升高的Ca²⁺信号动态，其中钙库耗竭、钙池操纵的Ca²⁺进入和calpain活性驱动细胞外囊泡（EV）生成；用螯合剂如BAPTA-AM阻断胞质Ca²⁺可有效消除EV释放，强调了囊泡形成和对接对Ca²⁺依赖性通路的依赖。总之，这些信号轴汇聚在一起决定了GBM分泌组的最终组成——结合高水平的VEGF和MMP相关的侵袭程序、NF-κB依赖性细胞因子如IL-6以及Ca²⁺调节的EV货物——以最佳方式支持血管生成、侵袭、免疫逃逸和治疗耐药。

4. GBM分泌组学中的方法学工作流程
质谱（MS）是蛋白质组学和分泌组学研究的基础工具。它能够识别和量化细胞释放的蛋白质。不同的MS技术在电离方法、分析器和样本制备方面有所区别。因此，方法的选择取决于研究目标和所需的细节水平。4.1 方法学格局：分泌组学中的MALDI-MS和LC-MS。质谱平台的选择涉及分析深度与通量之间的权衡。直接的MALDI基工作流程可能涉及光谱分析（“指纹识别”）、肽质量指纹图谱（PMF）或MALDI成像质谱（MALDI-MSI），具体取决于分析目标。光谱分析主要关注可重现的信号模式和生物标志物特征，而PMF则依赖肽质量匹配进行蛋白质鉴定。这提供了一种成本效益高的方法，用于以最少的制备筛选大量样本。然而，MALDI固有地受限于复杂混合物中的离子抑制；高丰度蛋白质（如白蛋白片段）经常掩盖低浓度的信号因子。虽然MALDI-TOF/TOF MS分析能够对选定的前体离子进行序列确认和快速光谱表征，但由于缺乏先行的色谱肽分离，直接的MALDI基工作流程通常提供比LC耦合串联MS方法更低的蛋白质组覆盖率。与直接的MALDI分析流程相反，LC耦合串联MS工作流程通过在电离前分离肽混合物，提供了显著更高的分析深度。这些工作流程可能使用电喷雾电离（LC-ESI-MS/MS）或基于MALDI的检测（LC-MALDI-TOF/TOF）。通过减少离子抑制和增加肽覆盖，LC耦合策略能够识别低丰度蛋白质和翻译后修饰（PTMs）。定量方法如SILAC、TMT或iTRAQ进一步增强了比较蛋白质组学分析。MALDI平台的一个独特优势是其扩展到MALDI质谱成像（MSI）。MSI通过直接在组织切片上绘制分子信号的空间分布（无需标记）来弥合分泌组学与组织学之间的差距。在胶质母细胞瘤研究中，这提供了关键的空间背景。多个研究人员可以将蛋白质定位与肿瘤边界和坏死区域相关联。这些信息在批量LC-MS/MS分析中通常会丢失。4.2 MALDI与LC-MS平台的批判性比较。MALDI和LC-MS/MS之间的选择取决于GBM研究的具体要求——是优先考虑信号通路的深度发现还是生物标志物特征的高通量筛选。表格1总结了这两个主导平台之间的技术权衡。MALDI-TOF MS不能代替LC-MS/MS进行从头生物标志物发现。LC-MS/MS在深度方面仍然是优越的方法。相反，MALDI的价值在于其作为临床筛选平台的角色。一旦发现蛋白质组学建立了一个蛋白质“命中列表”，MALDI-TOF MS就提供了监测这些特征的速度和成本效益。这允许分析大型患者队列，这在常规临床环境中对于LC-MS/MS通常是不可行的。

5. MALDI-TOF MS分泌组学中的技术限制与策略解决方案
基于MALDI的方法已应用于胶质母细胞瘤组织、囊液和模型系统。这些研究突出了技术限制，并提供了在样本制备、采集和生物信息学方面的优化策略。这些见解可直接适用于GBM分泌组重点关注的工作流程。5.1 样本制备中的关键参数。基质和洗涤：组织和细胞研究强调，洗涤必须去除盐分和污染物，而不使分析物移位。基质涂覆必须均匀以保留空间和强度信息。分泌液：对于GBM囊液，需要优化方案（包括弱阳离子交换富集）以可重现地检测约6-7 kDa的低质量分泌蛋白。低体积制备：对于高分辨率MSI和单细胞工作，使用等渗洗涤的温和固定可平衡形态和分子完整性。然而，多个研究人员必须控制胞质成分的泄漏以避免假象。5.2 GBM分泌组的策略优化。优化GBM分泌组分析涉及三个目标：（1）提取低丰度蛋白质如EV货物，（2）将它们与空间微环境联系起来，以及（3）监测治疗诱导的变化。以下策略解决了这些目标。EV重点蛋白质组学：GBM-EVs的自下而上MS识别了数千种蛋白质。这些包括侵袭相关的标志物和批量检测常遗漏的翻译后修饰。来源优化：条件培养基提供了高度富集肿瘤材料的EVs。与血液样本相比，这提高了低丰度因子的检测。分泌组分馏：分离EV和EV耗尽组分揭示了不同的蛋白质组。两个组分对免疫和微环境反应有不同的贡献。5.3 信号采集与“单肽”识别危机。MALDI-TOF MS通常产生有限的质量范围和重叠峰，这使蛋白质分配复杂化。为缓解这一问题，高分辨率MALDI-FTICR MSI可与区域特异性LC-MS/MS配对。这种对齐通过将准确质量与局部自下而上鉴定相匹配来减少假阳性。此外，单肽识别容易出现错误。使用稳定同位素基氨基酸质量标记可以提高特异性。该技术允许更高置信度的判定，特别是对于低丰度或膜蛋白。5.4 MALDI数据的生物信息学与功能解释。GBM分泌组学工作流程可以利用现有的生物信息学流程来确保数据质量。数据库搜索：像Sequest这样的搜索引擎应使用严格截止值，包括FDR<1%和至少两个独特肽的要求。功能注释：分析应侧重于与血管生成基质体和GBM进展相关的蛋白质。使用专门的EV数据库，如Vesiclepedia，有助于将肿瘤特异性置于背景中。临床相关性：将MALDI模式与患者结果联系起来，展示了可操作生物标志物组的可行性。用于GBM MALDI分泌组学的多阶段流程应：（1）区分经典与非经典分泌信号；（2）将结果与预后数据集如TCGA整合；（3）应用严格统计阈值以定义精炼的分泌组特征。总之，核心MALDI限制通过仔细的样本富集、高分辨率质谱和FDR控制的生物信息学得到缓解。当与临床数据整合时，这些工作流程将脆弱的肽命中转化为稳健的生物标志物组。

6. 已发表研究的综合：从深度发现到MALDI靶点
已发表研究的综合突出了一个策略流程：虽然通过LC-MS/MS的深度发现提供了GBM分泌组的全面图谱，但这些发现现在作为快速MALDI-TOF MS临床筛选的基础“命中列表”。以下部分评估这些研究并非作为竞争性方法，而是作为生物标志物开发的互补阶段。6.1 “核心”GBM分泌组：高丰度MALDI候选物。尽管方法各异，但几乎每项研究都出现了一组高丰度蛋白质——主要是细胞外基质（ECM）组分。诸如腱生蛋白-C（TNC）、纤连蛋白（FN1）和SPARC等蛋白质不仅在生物学上作为肿瘤硬度和侵袭的介导因子重要，而且由于其在高浓度条件培养基中的存在，也是MALDI-TOF MS分析的理想靶点。这些蛋白质不仅对GBM侵袭性至关重要，而且在MALDI光谱中产生高强度、可重现的峰。此外，分泌因子如YKL-40和骨桥蛋白，在侵袭性GBM表型中经常失调，可作为通过MALDI-TOF MS监测以追踪从低侵袭性到高侵袭性状态转变的稳健“哨兵”标志物。6.2 表型特异性标志物与方法学差异。研究报告的蛋白质计数差异（从150到近1000）主要反映了所用分析平台。例如，通过MS/MS发现工作流程在侵袭性GBM表型中鉴定的蛋白质如YKL-40，可作为未来基于MALDI的分析策略的候选靶点，旨在转化生物标志物开发。相比之下，患者来源球状模型（GICs）分泌独特的因子如Midkine（MDK）。MDK经常在血清培养的细胞系中被遗漏，这强调了需要能够在无血清、化学成分明确环境中操作的MALDI方案以捕获这些低丰度干性介导因子。6.3 弥合差距：为什么MALDI对这些发现很重要。虽然Gupta等人通过深度LC-MS/MS识别了近1000种蛋白质，但许多是低丰度细胞内污染物。对于临床转化，我们不需要检测每一种蛋白质；我们需要监测“分泌特征”。这些研究中鉴定的主要ECM和侵袭蛋白在MALDI光谱中产生独特的高强度离子。这证实了从LC-MS/MS“发现”到MALDI-TOF MS“筛选”的转变不仅是可能的，而且在生物学上是合理的。6.4 MALDI-TOF MS在分泌组学中的分析限制：从定量性能到潜在失败模式。与LC-ESI-MS/MS相比，MALDI-TOF(/TOF)通常提供中等分辨率（反射模式下约10,000或更高），具有皮摩尔-飞摩尔肽灵敏度，但在复杂临床样本中定量稳健性和分析灵敏度较低，没有富集则无法可靠检测低分析物负载。使用iTRAQ标记的大肠杆菌消化物的定量MS/MS比较显示，LC-MALDI-TOF/TOF和LC-ESI-QTOF在1:1至10:1范围内产生非常相似的肽比率，平均比率偏差仅为0.7-6.7%，但LC-MALDI使用更少的光谱并实现略低的序列覆盖率。然而，基于MALDI的定量固有地受到差的点间和点内重现性的阻碍，这是由于基质-分析物共结晶不均匀和随机激光采样，需要广泛平均和内标来近似LC-MS/MS常规实现的定量性能。在胶质瘤分泌组工作流程中，当残留盐或铵缓冲液降低肽灵敏度并促进基质簇形成（主导m/z 1200以下光谱）时，除非应用仔细优化的脱盐和洗涤（如磷酸铵），否则MALDI-TOF可能失败。胶质母细胞瘤细胞和EVs分泌的高丰度ECM蛋白和粘附分子可能主导这些样本的蛋白质组组成，可能限制低丰度趋化因子的检测。这一问题因离体或应激培养中的“泄露组”污染而加剧，其中受损细胞释放的细胞内蛋白质增加了强背景，掩盖了调节性、低水平分泌因子。常规MALDI基质在约700-800 m/z以下产生密集的化学背景，使得难以将低分子量细胞因子与基质簇区分开来；在富含ECM的胶质瘤分泌组中，这种低质量干扰结合丰基质体蛋白引起的离子抑制，为小细胞因子的假阴性MALDI-TOF结果提供了机制解释，即使LC-MS/MS能够检测到它们。

7. 临床验证与转化性“交接”
从体外分泌组“命中列表”到临床有用生物标志物的转变需要严格的验证级联。这一过程称为“临床交接”，涉及从广泛发现平台转向靶向、高灵敏度检测方法，能够在人类生物体液的巨大蛋白质背景中检测肿瘤衍生信号。7.1 从发现到靶向验证：SRM/PRM与免疫分析。虽然免疫学方法如ELISA或常规IHC对于单靶点验证仍然不可或缺，但它们在面对胶质母细胞瘤的极端瘤内异质性时遇到了显著限制。因此，从简单的免疫学筛选转向基于MALDI的平台并非由于抗体特异性不足——事实上，当代MALDI-IHC工作流程明确利用了质量标记抗体。相反，MALDI的关键优势在于其固有的多重分析能力。而标准免疫分析通常限制为每次运行1-5个分析物，单次MALDI采集可以同时调查数十种蛋白质、糖型和脂质物种，生成一个更忠实地捕捉肿瘤分子景观演变的整体“光谱指纹”，而不是任何单一抗体检测。7.2 生物体液基质分析挑战：CSF与血浆。将分泌组标志物转化为临床样本面临两个主要障碍：血脑屏障（BBB）和蛋白质浓度的动态范围。脑脊液（CSF）：作为与GBM微环境直接接触的液体，CSF富含肿瘤分泌组。然而，GBM衍生蛋白的浓度仍然比全身性白蛋白低几个数量级。CSF中的MALDI基筛选需要先进的前分级（如免疫耗竭白蛋白）以揭示“隐藏的”肿瘤特征。血浆/血清：BBB显著限制了大蛋白标志物进入体循环，通常使得分泌组候选物在没有超灵敏的细胞外囊泡（EV）富集的情况下无法在血液中检测到。从转化角度看，在血浆中检测这些标志物仍然是一个艰巨的挑战。血脑屏障（BBB）充当高度选择性的过滤器，确保脑衍生蛋白仅以极低浓度（皮摩尔至飞摩尔范围）存在于体循环中。此外，血浆蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白）的压倒性丰度在MALDI-TOF MS中产生了显著的“电离噪声”，经常掩盖胶质母细胞瘤特异性因子的细微光谱特征。7.3 标准化预分析流程。“临床交接”常因缺乏预分析严谨性而失败。诸如从采集到离心的时间、冻融循环次数以及特定蛋白酶抑制剂的使用等因素显著影响分泌组谱的稳定性。为使MALDI-TOF MS在临床环境中可行，必须实施生物体液处理的标准化操作流程（SOP），确保在临床记录到的“分子指纹”与实验室中发现的相匹配。为了解决体内相关性，基于MALDI的工作流程必须转向分析临床标本中的区域蛋白质组（如肿瘤核心与侵袭边缘）。尽管由于组织异质性在分析上具有挑战性，但这种方法提供了微环境重塑活跃介导因子的更准确读数。通过将体外分泌组谱与患者组织的MALDI成像（MSI）空间数据相关联，多个研究人员可以弥合发现与GBM微环境生物学现实之间的差距。

8. 技术与方法学限制：批判性评估
胶质母细胞瘤分泌组的固有复杂性——以蛋白质浓度的大动态范围和高糖基化水平为特征——对MALDI-TOF MS分析提出了独特挑战。与相对“干净”的细胞内蛋白质组不同，分泌组容易受到培养基添加剂和细胞碎片的污染，这会严重损害光谱质量。8.1 动态范围和离子抑制挑战。MALDI分泌组学中的主要限制是高丰度蛋白质的掩蔽效应。少数优势物种（如白蛋白片段或腱生蛋白）可以在激光解吸过程中垄断可用基质能量，有效抑制低丰度信号肽（细胞因子、生长因子）的电离。这种抑制不仅是仪器灵敏度问题，而且是基质晶体内部的基本物理化学竞争。为了缓解这一点，必须采用特定的蛋白质耗竭和分级结晶策略。8.2 故障排除与优化策略。为确保可重现和高分辨率的光谱指纹，多个研究人员必须系统地解决MALDI工作流程中最常见的失败模式。表格5提供了识别和解决这些方法学障碍的综合指南。

9. 未来研究前沿：迈向多模态与智能诊断
当前证据表明了一种范式转变。MALDI-MSI正与人工智能（AI）和互补成像模态整合，以创建多模态诊断平台。在此框架中，AI促进了复杂光谱数据到不同疾病表型的高通量转化。此外，纵向数据集的协同作用使得能够重建治疗反应的“分子电影”。空间配准的MSI进一步允许通过将分子特征与特定细胞微环境相关联，实现高分辨率“分泌组学”。9.1 AI驱动的光谱表型分析。AI模型对于处理复杂的MALDI数据至关重要。例如，单细胞MALDI-MSI脂质谱最近与MALDI-IHC结合。这种自动识别模型使用甘油三酯和鞘磷脂作为关键特征，准确区分了GBM与神经元细胞。类似地，“干式蛋白质组学”在脂质和蛋白质MALDI-MSI上采用无监督聚类。该方法定义了与预后相关的GBM亚组，并构建了稳健的分类模型。最后，从液体活检的MALDI-TOF MS光谱中基于分形的特征提取实现了GBD的机器学习诊断，表明即使压缩的模式描述符也携带重要的诊断信息。9.2 “分子电影”：治疗反应的纵向监测。专注于MALDI作为筛选工具允许高频、纵向监测。这种分泌组的“分子电影”使得能够检测单标志物免疫检测可能遗漏的多靶点特征，为实时治疗调整提供了更稳健的框架。一个多模态平台最近在GBM模型中结合了MALDI-MSI药物映射与磷酸化蛋白质组学。这种方法揭示了抑制剂adavosertib的异质性药物分布和适应性信号反应。此外，在手术中使用REIMS，结合MALDI-MSI和LC-MS/MS，实现了基于脂质模式的生存时间分类。同时，GBM模型中的空间分辨多组学流程已用于追踪代谢治疗效应，如精氨酸耗竭。这些研究强调了肿瘤核心与其边缘之间反应的关键差异。9.3 空间分泌组学：MALDI-MSI与血管周微环境。虽然并不总是标记为“分泌组学”，但多项以MALDI为中心和多模态研究探究了GBM中的空间代谢和蛋白质组微环境。在小鼠胶质瘤模型中，超高分辨率MALDI-FTICR MSI与微蛋白质组学描绘了肿瘤特异性蛋白形式和代谢蛋白，解析了构成局部功能状态的异质性区域。类似地，大型GBM队列中的脂质和肽MALDI-MSI揭示了与患者生存相关的空间独特微环境。先进的MSI技术结合同位素示踪，也已绘制了胶质瘤模型中的代谢流量。这项研究暴露了脑生态系统内肿瘤特异性合成代谢活动。最后，空间转录组学已识别了具有独特炎症程序的血管周和坏死周微环境。将MALDI-MSI与这些数据集整合将实现真正的“空间分泌组学”，允许详细研究巨噬细胞-内皮细胞-肿瘤相互作用。除成像外，单细胞蛋白质组学和微流体基分泌组分析的整合提供了一条解析GBM极端细胞异质性的途径。虽然微流体允许从极少量细胞高灵敏度捕获分泌因子，但单细胞方法确保“平均”分泌组信号不会掩盖罕见的、高侵袭性克隆。此外，将这些蛋白质水平发现与空间转录组学数据对齐将实现肿瘤微环境的完整多组学重建，提供基因表达如何转化为功能性分泌蛋白质组的最终图谱。

10. 一般讨论与结论
分泌组分析代表了胶质母细胞瘤研究中的一个关键功能层，捕捉了肿瘤与其微环境之间的活跃界面——这是静态基因组或转录组分析经常遗漏的层面。然而，为了使MALDI-TOF MS实现其作为诊断工具的潜力，该领域必须解决离子抑制、动态范围和预分析变异性的持续挑战。当前研究的综合证实了一种“混合”方法——利用LC-MS/MS进行深度发现和MALDI-TOF MS进行快速高通量验证——是生物标志物开发最稳健的策略。虽然细胞系作为发现平台仍然不可或缺，但空间成像（MSI/IHC）和多组学数据的整合对于弥合体外发现与临床现实之间的差距是必要的。虽然本综述聚焦于胶质母细胞瘤，但MALDI-TOF MS分析的潜力扩展到其他恶性肿瘤。例如，基于MALDI的光谱指纹识别和成像越来越多地用于分类乳腺癌亚型、鉴定胰腺囊液中诊断标志物以及绘制肺和前列腺肿瘤的代谢异质性。MALDI-TOF MS在不同实体瘤中捕获快速“分子特征”的多功能性突显了其作为可扩展临床平台在肿瘤学中的广泛实用性。总之，如果样本制备和生物信息学过滤（如SignalP、FDR控制）的方法学标准被严格应用，基于MALDI的分泌组学将从探索性研究工具转变为个性化GBM管理的基石。通过AI驱动的MALDI平台从“识别蛋白质”到“分类分子特征”的转变，为更精确、功能相关的诊断和治疗监测提供了一条有前景的途径。