利用氧化铟锡(Indium-Tin-Oxide, ITO)图案化微阵列芯片的细胞微图案化(Cell Micropatterning)方法

《Analytica Chimica Acta》：Cell Micropatterning Method Using Indium-Tin-Oxide Patterned Microarray Chip

　　

细胞微图案化是阐明细胞间通讯及单细胞与细胞群体行为的重要技术。然而，基于化学修饰细胞黏附/非黏附表面的传统微图案化方法面临显著挑战：需针对不同细胞类型优化基底表面，且图案化精度存在变异。本研究提出一种利用氧化铟锡(Indium-Tin-Oxide, ITO)图案化微阵列芯片结合紫外C(Ultraviolet C, UVC, 254 nm)辐照的新型细胞微图案化方法。通过将贴附有细胞的ITO微阵列芯片暴露于UVC光，ITO层上的U-87细胞增殖形成细胞层，同时相邻细胞层间的接触被阻断，最终形成与ITO层几何形状一致的独立U-87细胞层。该方法允许在平面表面进行结构无限制的細胞培养，并可自由涂覆最适合细胞培养的基质材料，且图案化过程中无需控温或施加电压等附加步骤。此外，由于该过程不依赖因细胞类型差异显著的细胞黏附或非黏附化学因子，预期在不同细胞种类中均能保持一致性表现。因此，所提方法可在简易平面平台上构建最优低应力细胞培养环境，无需专用微结构或黏附因子。

利用ITO图案化微阵列芯片与UVC辐照的新型细胞微图案化方法研究解读

研究背景与意义

细胞微图案化（Cell Micropatterning）技术是细胞生物学中精确排列细胞于限定区域以研究细胞-细胞相互作用、组织工程、再生医学及药物筛选的关键手段。现有方法包括微结构法、声学法、介电泳法及细胞黏附表面修饰法（如光刻、微流控图案化、微接触印刷）。传统黏附表面修饰法虽可实现单细胞级高分辨率，但存在两大瓶颈：(1) 需针对特定细胞类型优化表面化学修饰，难以构建普适性最优培养支架；(2) 水凝胶等修饰层在清洗后易变性，无法重复使用导致成本高昂。微结构法则存在加工成本高、可能抑制细胞间通讯的问题；声学与介电泳法存在分辨率低、需专用设备且可能对细胞造成损伤。鉴于此，Hidetaka Ueno与Shohei Yamamura开展本研究，旨在开发一种基于物理屏蔽原理、无需细胞类型特异性黏附因子、基底可自由涂层且可重复使用的简易细胞微图案化新方法。论文发表于《Analytica Chimica Acta》。

主要关键技术方法

研究人员采用以下核心技术与实验设计：(1) 利用磁控溅射（Sputtering）在合成石英玻璃（Synthetic Silica Glass）上沉积不同厚度ITO膜，通过台阶仪与紫外-可见分光光度计测定ITO厚度及其在254 nm处的透光率，确定UVC屏蔽所需最小厚度；(2) 通过光刻（Photolithography）与湿法蚀刻（Wet Etching）制备具六边形培养区的ITO微阵列芯片（蜂巢状与孤立状两种排布，六边形对角线设750 μm与450 μm，间隙设约86.6、43.3、21.65 μm），并用倒置荧光显微镜与ImageJ评估加工精度；(3) 芯片经胶原I型（Type I Collagen）包被后接种GFP标记的人胶质母细胞瘤U-87细胞，培养24 h后从芯片背面进行UVC（254 nm，强度1.73 mW/cm²）每日辐照（0、10、20 min对应0、1038、2076 mJ/cm²剂量），隔日观察细胞覆盖面积与跨间隙连接数，验证图案化效果。

研究结果

3.1. Transmittance of ITO layer and other materials（ITO层及其他材料的透光率）

通过台阶仪测得溅射5、25、50 min所得ITO厚度分别为85.5 nm、420.4 nm、833.4 nm。透光率测试显示：254 nm处，85.5 nm厚ITO/石英透光率为6.75%，而≥420.4 nm厚ITO层透光率低于检测限（LOD）；裸石英玻璃透光率达91.30%，聚苯乙烯板与半白玻璃透光率极低。结论：ITO厚度≥420.4 nm时可有效屏蔽254 nm UVC；石英基底高透UVC，二者组合可在芯片表面形成鲜明UVC强度对比度，为选择性杀伤间隙区细胞提供物理基础。

3.2. Fabrication results of ITO microarray chip（ITO微阵列芯片的加工结果）

选用靶厚833.4 nm ITO层经光刻与ITO蚀刻液湿法蚀刻制成六边形图案化芯片。实测六边形对角线加工误差40.92–53.43 μm（蜂巢型）与42.42–48.65 μm（孤立型），间隙误差2.00–24.53 μm与0.04–13.66 μm，存在恒定侧向钻蚀（Undercut, 约12–20 μm）致六边形尺寸略小于设计值，但钻蚀宽度较均一。结论：通过预补偿钻蚀量可实现较精确图形转移；不同设计尺寸ITO图案可成功制备，满足后续UVC图案化评估需求。

3.3. Cell micropatterning（细胞微图案化）

无UVC辐照组培养2 d后U-87细胞布满ITO区与间隙，跨间隙连接数＞10；日剂量1038 mJ/cm²时间隙连接数减少，2076 mJ/cm²时间隙连接完全消失（跨间隙连接数为0），而ITO区细胞覆盖率与未辐照组相比差异＜5%（例：H_5图案1038 mJ/cm²下覆盖率62.77% vs 对照61.34%）。结论：每日周期性UVC背照可选择诱导间隙区细胞凋亡并抑制其迁移，ITO区受保护细胞正常增殖，最终实现与ITO几何完全吻合的独立细胞微图案；适当匹配图案尺寸与UVC剂量可在不损害图案区细胞存活/增殖前提下彻底隔离各微图案单元。即使对高迁移能力的U-87细胞亦可实现≤500 μm尺度有效图案化，表明方法对不同细胞类型具潜在普适性。

讨论与结论翻译

讨论指出：本方法利用化学稳定的无机ITO/石英体系，表面可均匀包被任意最适细胞外基质（ECM），不受细胞类型黏附因子差异限制；芯片耐强溶剂清洗，具备重复使用潜力（待后续验证）。背照式UVC无光掩模与细胞间空隙引起的衍射问题，且可与倒置显微镜兼容，未来有望整合至自动化活细胞成像系统。局限性含湿法蚀刻钻蚀限制更小图案评估、芯片复用性及UVC诱发DNA损伤长期影响、单一细胞株验证等，需进一步研究。

结论：研究人员提出并验证了利用沉积于合成石英玻璃上具UVC屏蔽能力ITO图案层与周期背侧UVC辐照的新细胞微图案化法。ITO层（厚≥420.4 nm）阻挡254 nm UVC保护其上方细胞，间隙透过UVC诱导细胞凋亡，经日剂量优化可获与ITO图形一致且相互隔离的细胞图案，ITO区细胞活力与增殖不受明显影响。因ITO微阵列芯片由化学稳定无机材料构成且UVC生物效应具广谱性，表面可自由选用最适包被材料，无需温控或加电压，仅需常规UVC光源即可完成图案化。该法是一种简便、可靠、具高通用性与易用性的细胞微图案化新技术。