金鱼（Carassius auratus）肠道中的神经免疫相互作用：对肠神经元和免疫细胞组织的见解

《Fishes》：Neuroimmune Interactions in the Intestine of Goldfish (Carassius auratus): Insights into Enteric Neurons and Immune Cell Organization

　　

肠道中的神经免疫相互作用对于维持组织稳态至关重要，但在硬骨鱼中仍知之甚少。本研究采用半薄组织学、透射电子显微镜（TEM）和共聚焦免疫荧光技术，研究了金鱼（Carassius auratus）肠道中肠神经元和免疫细胞的结构和细胞组织。组织学观察显示，由肠细胞和杯状细胞组成的上皮结构良好，基底上皮中有大量淋巴细胞。在固有层和黏膜下层中发现了突出的肠道相关淋巴组织（GALT），既有弥散形式也有聚集形式。巨噬细胞广泛分布于所有肠道层，并一致发现与肠神经元和神经纤维紧密相邻。超微结构分析证实了巨噬细胞与神经元元素之间的直接接触。这些巨噬细胞表现出典型的吞噬特征，包括溶酶体、空泡和被吞噬的物质，特别是在与肌间神经丛神经纤维相关联时。免疫荧光分析显示，巨噬细胞和肠细胞中toll样受体2（TLR2）和主要组织相容性复合体II类（MHC II）的强烈表达，表明其在抗原识别中发挥积极作用。在黏膜下层中发现了Langerin阳性的树突样细胞，而CD4阳性的淋巴细胞与5-羟色胺（5-HT）表现出部分共定位。S100阳性细胞与5-HT也有部分重叠，杯状细胞表现出5-HT免疫反应性。此外，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）与黏膜下层免疫细胞中的TLR2共定位。这些发现表明金鱼肠道中肠神经元与免疫细胞之间存在密切的结构和功能关联，突出了整合的神经免疫网络。

该论文发表在《Fishes》上，针对脊椎动物肠道中神经免疫相互作用这一重要但研究不足的领域，以硬骨鱼金鱼（Carassius auratus）为模型，系统探究了肠神经元与免疫细胞的空间组织和功能关联。研究背景指出，肠道作为外界环境与机体的主要界面，其神经与免疫组分通过双向通信维持组织稳态，这一机制在哺乳动物中已有较多描述，但在硬骨鱼中尚不明确。目前存在的主要问题包括：硬骨鱼肠道内肠神经元与免疫细胞（巨噬细胞、淋巴细胞、树突样细胞等）之间的精确空间组织及超微结构相互作用缺乏详细表征；神经免疫网络在鱼类肠道中的分子标志物表达及其功能意义尚未被系统揭示。金鱼因具有发达的肠神经系统（ENS）和独特的肠道相关淋巴组织（GALT），成为探索神经免疫整合机制的理想模型。为此，研究人员开展了一系列组织学、超微结构和免疫荧光研究，以描绘金鱼后肠中神经与免疫细胞的结构关系及分子特征。主要结论包括：金鱼肠道中存在高度组织的神经免疫微环境，巨噬细胞与肠神经元直接接触且具有吞噬活性；肠细胞和免疫细胞广泛表达toll样受体2（TLR2）和MHC II；Langerin阳性的树突样细胞、CD4⁺淋巴细胞与5-羟色胺（5-HT）存在共定位；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）与TLR2在黏膜下层共表达。这些结果证实了硬骨鱼肠道中存在整合的神经免疫网络，对理解脊椎动物肠道免疫调节的进化具有重要意义。

研究人员为开展本研究采用的主要关键技术方法包括：半薄切片组织学（甲苯胺蓝染色）用于肠道各层细胞结构的光镜观察；透射电子显微镜（TEM）用于超微结构分析，直接观察巨噬细胞与神经元素之间的接触；共聚焦免疫荧光双标技术用于检测TLR2、MHC II、Langerin、5-HT、S100蛋白、CD4和iNOS等标志物的分布及共定位。样本来源于18尾健康成年金鱼（体长7.0-8.0 cm，购自实验室鱼类设施），肠道组织经固定、脱水、包埋后制备切片。半定量分析通过ImageJ软件统计不同肠道层中巨噬细胞样阳性细胞的密度。不涉及具体试剂和培养、质粒构建步骤。

3.1 组织学观察：通过半薄切片和甲苯胺蓝染色，研究人员观察到金鱼后肠上皮由肠细胞和杯状细胞组成，基底上皮中存在大量淋巴细胞。在固有层和黏膜下层中，GALT以散在和聚集两种形式存在，主要由密集的淋巴细胞和巨噬细胞构成。巨噬细胞在黏膜下层与肠神经元及神经纤维紧密相邻，在肌层中也与神经元和神经纤维接近。

3.2 超微结构发现：通过透射电镜（TEM），研究人员证实巨噬细胞在上皮和黏膜下层中与神经纤维和肠神经元直接接触；在肌层中，巨噬细胞含有溶酶体、空泡和吞噬物，并与肌间神经丛的神经纤维形成密切联系，显示其处于活跃功能状态。

3.3 免疫荧光分析：通过共聚焦免疫荧光双标，研究人员发现：TLR2和MHC II在淋巴组织聚集中的巨噬细胞上共表达，在肠细胞顶端区域也有强阳性；Langerin和TLR2在黏膜下层树突样细胞中呈阳性并共定位；CD4阳性淋巴细胞与5-HT呈现部分共定位；S100阳性细胞与5-HT部分重叠；杯状细胞形态的结构和微绒毛边界显示5-HT免疫反应性；黏膜下层免疫细胞中iNOS与TLR2共定位。

3.4 巨噬细胞密度分析：半定量分析显示，巨噬细胞在黏膜下层密度最高，其次为肌层，上皮层密度最低，与形态学观察一致。

在讨论部分，研究人员指出：金鱼肠道存在高度组织的神经免疫微环境，巨噬细胞与肠神经元的结构关联提示神经保护与免疫调节机制在硬骨鱼中已存在。GALT的发达反映了黏膜免疫在鱼类中的核心作用。TLR2与MHC II在巨噬细胞和肠细胞的共表达表明这些细胞协调先天与适应性免疫，肠细胞的顶侧定位支持其直接感知管腔抗原。Langerin阳性树突样细胞提供了鱼类GALT中专门抗原提呈群体的证据。5-HT与CD4阳性淋巴细胞及S100阳性细胞的部分共定位提示5-羟色胺能神经免疫通路的存在，且在杯状细胞中的免疫反应性可能指示其释放到肠腔中调节屏障功能和微生物互作。iNOS与TLR2的共表达表明黏膜下层是先天免疫激活的重要部位。整体上，这些发现被置于营养-微生物群-免疫-神经网络的背景下理解，强调了该网络中微生物群对TLR2表达、iNOS活性和5-HT合成的潜在影响。研究也指出，由于仅聚焦于后肠，区域差异未被评估，且缺乏功能性验证是当前工作的局限性。结论部分翻译如下：当前研究发现提示金鱼肠道包含一个整合的神经免疫系统，其特征是肠神经元、上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和树突样细胞之间的复杂相互作用。本研究中观察到的密切解剖关系及重叠分子标志物强烈支持神经与免疫区室之间存在协调的信号通路。这些观察为脊椎动物肠道神经免疫调节的进化提供了新见解，并支持金鱼肠道作为研究肠道神经生物学和黏膜免疫的有价值比较模型。