《Annual Review of Analytical Chemistry》：Single-Cell Protein Assays in Context: From 2D to 3D and In Situ Analysis
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单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, scP）是单细胞转录组学的重要补充，可在二维（2D）细胞培养、三维（3D）模型及患者组织中更深入地揭示细胞异质性、疾病机制及治疗脆弱性。尽管转录组学能实现高通量基因表达表征，但即使在同一细胞中m
单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, scP）是单细胞转录组学的重要补充，可在二维（2D）细胞培养、三维（3D）模型及患者组织中更深入地揭示细胞异质性、疾病机制及治疗脆弱性。尽管转录组学能实现高通量基因表达表征，但即使在同一细胞中mRNA水平与蛋白质水平也常无相关性。此外，蛋白质异构体、翻译后修饰（posttranslational modifications, PTMs）及蛋白复合物无法被转录组学分析所检测。本综述探讨了现代scP技术，包括流式细胞术（flow cytometry, FC）与质谱流式细胞术（mass cytometry/CyTOF）、单细胞质谱（single-cell mass spectrometry, scMS）、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）、循环成像（cyclic imaging）及成像质谱细胞术（imaging mass cytometry, IMC），并应用于解离样本与空间保存样本。研究人员强调将这些技术应用于器官芯片（organ-on-a-chip）、类器官（organoids）、球体（spheroids）及完整组织，重点阐述空间分辨率与多重检测能力方面的进展，并讨论各平台在通量、空间保真度及蛋白质选择性之间的权衡。最后，研究人员指出关键的测量空白，并提出未来实现空间分辨scP临床转化的方向。
一、研究背景与综述目的
单细胞转录组学虽已揭示大量生物学信息，但mRNA与蛋白质丰度在单细胞中相关性较差，且转录组学无法检测翻译后修饰（PTM）、蛋白异构体及蛋白复合物——这些恰恰是疾病靶向治疗和药物开发的关键功能特征。因此，单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, scP）成为必要补充。传统scP技术如免疫组织化学（IHC）和流式细胞术（FC）通量、灵敏度及多重检测能力有限。近年来新兴scP技术发展迅速，但其在三维（3D）模型（类器官、球体、器官芯片）及空间保存（原位）组织中的应用尚待系统梳理。本文由Vlassakis J.等撰写，发表于《Annual Review of Analytical Chemistry》，旨在按"不保留空间信息"与"保留空间信息"两大类归纳scP技术，评述其在2D、3D及原位样本中的应用现状、优缺点及未来临床转化前景。
二、主要关键技术方法概述
研究人员通过文献综述法，系统调研并对比了以下主要技术手段在2D培养细胞、解离3D模型（酶解获得单细胞悬液）及空间完整组织/切片（含FFPE切片）中的应用：荧光激活细胞分选/流式细胞术（FACS/FC）、质谱流式细胞术（CyTOF，即cytometry by time of flight）、单细胞免疫印迹（single-cell western blot, scWB）、纳米级单锅处理痕量样品（nanoPOTS及nanoPOTS 2）及串联质量标签标记单细胞蛋白质组学（SCoPE-MS/SCoPE2）、循环免疫荧光（cyclic immunofluorescence, CycIF/t-CycIF）及共检测索引（co-detection by indexing, CODEX）、成像质谱细胞术（imaging mass cytometry, IMC）与多重离子束成像（multiplexed ion beam imaging, MIBI）、纳米电喷雾解吸电喷雾电离质谱成像（nano-DESI MSI）、组织膨胀质谱成像（tissue expansion mass spectrometry imaging, TEMI）、原位空间标签化质谱（SPOT）、深度视觉蛋白质组学（deep visual proteomics, DVP）结合激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）。样本来源涵盖2D细胞系、肝癌/结肠癌/乳腺癌/神经类器官（patient-derived organoids, PDOs）、肿瘤球体、器官芯片模型及人临床FFPE组织。
三、研究结果（按原文小节）
SINGLE-CELL PROTEIN TECHNIQUES THAT DO NOT PRESERVE SPATIAL CONTEXT（不保留空间背景的单细胞蛋白质技术）
此部分涵盖需将3D样本完全酶解为单细胞悬液从而丢失细胞原位位置与细胞间接触信息的技术。文中以对比表（Table 1）汇总各scP方法在空间保存、可检蛋白靶点数、最低细胞数、通量、选择性及成本上的差异。
FLOW CYTOMETRY AND MASS CYTOMETRY（流式细胞术与质谱流式细胞术）
FC/FACS可通过荧光标记抗体检测约30个参数/细胞，商业成像流式（如Cytek Amnis、BD FACSDiscover?）可提供一定亚细胞定位信息。CyTOF用稀土金属标记抗体，可同时定量约60个蛋白标志物/细胞，无光谱补偿问题。二者均需单细胞悬液，适合高通量异质性分析但丢失空间信息。
FLOW CYTOMETRY– AND MASS CYTOMETRY–BASED PROTEOMIC PROFILING OF DISSOCIATED 3D SAMPLES（基于FC与MC的解离3D样本蛋白质组分析）
研究人员指出FC和CyTOF已成功用于解离肝细胞癌球体、黑色素瘤水凝胶支架、胆管癌类器官-T细胞共培养及乳腺/卵巢/肺癌球体浸润T细胞表型分析，以及人iPSC来源中脑类器官脑细胞分型（CelltypeR流程）。CyTOF亦用于结直肠正常/癌类器官及乳腺PDO的磷酸化信号网络与上皮亚型鉴定。局限性为酶解过程引入偏差、丢失空间背景、固定透化可能影响表位可及性、低起始细胞易损失及CyTOF仪器昂贵。
SINGLE-CELL IMMUNOBLOTTING（单细胞免疫印迹）
单细胞Western Blot（scWB）通过在聚丙烯酰胺凝胶（PAG）微孔中捕获单细胞、裂解、电泳分离、UV光固定及荧光免疫探针检测，可分辨蛋白异构体与复合物（双向分离可检测蛋白复合），每细胞检测约25个蛋白/异构体，灵敏度约>27,000拷贝/细胞。改进包括z平面分离提通量、温控多孔凝胶改善抗体渗透、膜转移信号放大。目前scWB在3D样本应用较少，但有ContactBlot研究细胞接触对ERK信号影响，具扩展至3D模型的潜力。
SINGLE-CELL MASS SPECTROMETRY（单细胞质谱）
nanoPOTS平台在纳升级液滴中制备单细胞供LC-MS/MS分析，结合串联质量标签（tandem-mass tags, TMT）可提高通量（NanoPOTS 2），检测数千种蛋白/细胞。SCoPE-MS/SCoPE2用等压TMT标记混样加载体细胞提高肽段鉴定，可定量约3,000蛋白/细胞。Mann组采用FACS分选单细胞直接进样结合数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA-MS）及二甲基硫代标记提升低丰度离子检测。主流scMS仍偏2D悬浮/贴壁细胞。
MASS SPECTROMETRY–BASED SINGLE-CELL PROTEOMICS ANALYSES OF DISSOCIATED 3D SAMPLES（基于MS的解离3D样本单细胞蛋白质组分析）
DIA-MS结合DiagnoMass流程已用于iPSC来源Rett综合征脑类器官解离单细胞谱，区分神经祖细胞与健康/患者差异。FACS分选解离人脑类器官神经细胞后进行LC-MS可识别细胞类型特异性富集通路（DNA复制vs轴突发育），且蛋白-转录水平不一致凸显蛋白组价值。另有研究优化Matrigel解离方法（Dispase酶消化最优）以减少基质干扰。Orbitrap MS也曾分析完整未解离脑类器官整体蛋白/脂质，但未达单细胞分辨率。
SINGLE-CELL PROTEIN TECHNIQUES THAT CONSERVE SPATIAL INFORMATION（保留空间信息的单细胞蛋白质技术）
此部分包括可直接用于完整切片或全组织保留细胞原位、邻域关系及形态的技术。
Immunocytochemistry / Cyclic Imaging in 3D Samples / Imaging Mass Cytometry in 3D Samples / Multiplexed Immunohistochemistry for In Situ Tissue Analyses（免疫细胞化学、3D样本循环成像、3D样本成像质谱细胞术及原位组织多重IHC）
传统IHC/ICC经改良发展出循环免疫荧光（CycIF/t-CycIF），多轮染色-成像-漂白可检测数十靶标，自动化配合CellProfiler等软件分析。CODEX用寡核苷酸条形码抗体+荧光报告可检测>50靶标。CycIF已应用于胶质母细胞瘤类器官、肺癌/结直肠癌球体FFPE切片、肠/肿瘤类器官-PBMC共培养模型，保留3D架构下亚细胞定位。成像质谱细胞术（IMC）用金属标记抗体+激光烧蚀TOF检测，可获32–40靶标/像素(1 μm分辨率)，已用于肺腺癌细胞聚集体切片及连续切片3D重建乳腺瘤块。多重离子束成像（MIBI）用离子束更灵敏但较慢。IMC可通过DNA条形码信号放大（SABER-IMC）检测低丰度蛋白。上述空间技术瓶颈含胞内抗体穿透、密集组织分割难、低丰度检测限、仪器昂贵及样品破坏性。
EMERGING TECHNOLOGIES: IN SITU SPATIAL PROTEOMICS（新兴技术：原位空间蛋白质组学）
质谱成像（MSI）如nano-DESI可达~7–10 μm分辨率做无标记空间蛋白定位；DISCO-MS结合组织透明化与机器人采样做3D全身器官空间免疫异质性与斑块分析；组织膨胀质谱成像（TEMI/ProteomEx）通过水凝胶膨胀提空间粒度。SPOT（Spatial Proteomics through On-site Tissue protein labeling）在原位用TMT标记进行区域分辨全局蛋白质组。智能图像-质谱联用方法：深度视觉蛋白质组学（DVP=Mann lab）结合AI图像分割、LCM及高敏MS，从~100–300个细胞核/区获>4,000独特蛋白，用于黑色素瘤、α1-抗itrypsin缺陷肝病等分期表型；稀疏采样策略（S4P）以条带采样+计算重建降低MS时间；PLATO用微流控平行流投影+迁移学习（Flow2Spatial）重构空间模式但暂未达单细胞分辨率且无PTM信息。CODEX亦归于此类原位高维空间蛋白图谱工具。
FUTURE OUTLOOK FOR CLINICALLY INTEGRATED SPATIAL PROTEOMICS（临床整合空间蛋白质组学前瞻）
当前挑战含灵敏度-分辨率-速度-通量权衡、成像循环光漂白与串色、MS前处理耗时、缺乏跨平台标准化数据分割与量化流程、AI分割算法多样性阻碍非计算背景研究者使用、部分技术（PLATO、S4P）尚不适临床快节奏或稀缺标本。但随着自动化、灵敏度提升及算法标准化，空间蛋白质组学将在保留解离法丢失的空间语境基础上，实现对肿瘤-免疫微环境、3D模型及临床标本的高分辨解析，推动精准诊断与治疗靶点发现。
四、结论（翻译讨论/结论要点）
尽管空间蛋白质组学近年取得显著进展，但在原位蛋白质检测技术中平衡灵敏度、空间分辨率、速度和通量仍有困难。多重成像系统须管理多轮荧光团串扰与光漂白，而基于质谱的流程常需耗时的样品制备以减少蛋白吸附损失。从解离细胞向复杂3D组织及临床标本过渡时，数据分割、定量及仪器优化之标准化尤为困难。PLATO尚不适用于快节奏临床环境；S4P需多片组织且有损伤风险，限制其在稀少标本中应用；AI图像分割算法多样且缺统一流程也影响非计算专业人员可及性。尽管如此，融合成像、机器学习及蛋白质定量的智能空间蛋白质组学工具正绘制完整组织中蛋白分布图谱、揭示肿瘤-免疫结构并增强2D/3D模型分析。随灵敏度与自动化提升，这些方法将更具可扩展性，保留解离工作流程中丢失的空间背景信息，推动未来诊断与治疗应用。
