下一代蛋白质测序(Protein Sequencing)与分析方法的进展

《Annual Review of Analytical Chemistry》：The Next Generation of Protein Sequencing and Analysis Methods

　　

蛋白质测序与分析技术的进步有望通过大规模关联序列、结构与功能，变革蛋白质组学(Proteomics)，从而加速生物学发现与生物医学创新。然而，蛋白质分析面临独特挑战：无法扩增、具有复杂化学结构且存在海量蛋白质变体(Proteoform)。质谱(Mass Spectrometry, MS)通常是大规模蛋白质组学研究的主力手段，但新一代技术正在突破边界，有望实现从头(De Novo)、单分子及/或更高效的通量测序与分析。尽管许多策略尚处早期阶段，部分模式——如荧光测序(Fluorosequencing)、单分子测序、数字蛋白质组作图(Digital Proteomics Mapping)及基于纳米孔(Nanopore)的蛋白质测序——已达或接近商业化应用。研究人员在此综述中评估了这些技术的原理、当前进展及剩余挑战，并强调近期创新如何推动迈向新一代蛋白质组学技术。

《Annual Review of Analytical Chemistry》刊载综述解读：下一代蛋白质测序与分析技术进展

一、研究背景与开展原因

蛋白质组学旨在理解细胞与组织中蛋白质的多样动态景观，这是仅凭基因组无法推导的。虽然蛋白质序列可由编码基因推断，但真实生物系统中蛋白质丰度反映实时功能状态，且RNA转录水平不足以代表翻译效率与蛋白稳定性差异带来的丰度变化。更重要的是，单一基因经蛋白水解、可变剪接及翻译后修饰(Post-Translational Modification, PTM)可产生无数具生物学意义的蛋白质变体(Proteoform)。传统Sanger法和Edman降解通量低且要求纯化未封闭N端；现行质谱(Mass Spectrometry, MS)虽为标准手段，但在动态范围广、序列覆盖率不均及完整Proteoform和某些PTM检测方面存在局限。鉴于此，研究人员需综述新兴可实现单分子、从头(De Novo)读取、高通量分析的新一代蛋白质测序与分析技术，阐明其机制、进展与挑战。

二、主要关键技术方法概述

研究人员采用文献综述法，聚焦接近商业化或已展示应用潜力的成熟平台，包括三类荧光为基础的方法——Erisyon荧光测序(Fluorosequencing)、Quantum-Si单分子N端识别测序、Nautilus Biotechnology迭代映射(IMaP)数字蛋白质组指纹技术，以及固态与生物纳米孔(Nanopore)传感技术（含游离转运、功能化孔、酶介导转运如ClpX解折叠酶及蛋白酶体-纳米孔融合系统），结合文献中已发表的原理验证实验与概念演示案例进行归纳分析。

三、研究结果

INTRODUCTION（引言）

研究人员指出蛋白质直接分析对捕获Proteoform复杂性至关重要；Edman降解与MS奠定基础但有局限；新一代受二代DNA测序启发，荧光策略（Erisyon、Quantum-Si、Nautilus）与纳米孔技术分别代表标记依赖与非标记路线，二者互补可推动领域发展。

FLUORESCENCE-BASED METHODS（基于荧光的方法）

因20种氨基酸难以各配独特色谱荧光基团且无"合成测序"模板，当前荧光法通常读取部分序列信息用于数据库匹配指纹鉴定，而非全长从头测序。

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  Erisyon：采用荧光测序(Fluorosequencing)，肽用氨基酸特异性荧光标记多肽（Promers）标记并固定表面，经Edman降解逐轮切除并用全内反射荧光(TIRF)显微镜成像，荧光阶梯变化形成氟序列比对数据库。可平行读取百万肽分子，zeptomole级鉴定蛋白，可报告PTM（如磷酸丝氨酸），但目前仅为稀疏残基覆盖，依赖数据库匹配，误差源于光漂白、不完全切割及表面丢失。
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  Quantum-Si（Platinum系统）：肽固定于半导体芯片纳腔，用染料标记N端氨基酸"识别子(Recognizer)"结合产生特征脉冲动力学，氨基肽酶(Aminopeptidase)逐步切除N端（除脯氨酸外），结合荧光强度与寿命鉴别氨基酸。初始3种识别子覆盖7种氨基酸，更新试剂盒新增识别子覆盖至约83.5%人源氨基酸。已用于白细胞介素-6(IL-6)互补MS分析、原肌球蛋白Proteoform区分及纳米抗体-配体互作筛选，PTM广泛鉴定尚待完善。
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  Nautilus Biotechnology（IMaP平台）：不测序列而用迭代映射Proteoform(IMaP)，完整蛋白偶联DNA折纸纳米颗粒固定流动池，循环引入荧光标记抗体/适配子结合特定表位或PTM，积累数字化结合模式指纹。以Tau蛋白为例用12种抗体验证，鉴定130种Proteoform组并量化磷酸化化学计量，发现疾病与健康样本磷酸化模式差异。局限为依赖高质量亲和试剂，适合靶向定量而非全新发现。

NANOPORE METHODS（纳米孔方法）

纳米孔系统两室间加电压，分子易位(Translocation)引起离子电流阻断特征信号。分固态(Solid-State)与生物(Biological)纳米孔。

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  Solid-State Nanopores（固态纳米孔）：经聚焦离子束或介质击穿等制孔（Si₃N₄、二维材料等），用变性剂（SDS赋予负电促电泳、盐酸胍）或DNA"穿线"助 unfold 与转运；通过pH调节等电点、表面修饰、交变偏压等延长停留时间(Dwell Time)。可区分蛋白尺寸/形状/偶极矩，个别研究达亚Da分辨区分氨基酸/异构体/PTM，但信噪比、短停留时间及制孔一致性仍限制高分辨测序。
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  Biological Nanopores（生物纳米孔）：
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    Free Translocation（游离转运）：最早用α-溶血素(α-Hemolysin, αHL)及气溶素(Aerolysin)，短肽可过孔，全长蛋白需变性剂线性化并常需加负电尾或工程孔内表面电荷诱导电渗流(Electro-Osmotic Flow, EOF)驱动；微秒～毫秒级过快难解析序列特征。
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    Functionalized Nanopores（功能化纳米孔）：孔内感应区螯合Ni²⁺等与氨基酸形成双齿配位延长停留，工程MspA孔可区分所有蛋白原氨基酸及部分修饰氨基酸，但未见从完整蛋白递送氨基酸序列演示。
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    Enzymatic Translocation（酶介导转运）：DNA解旋酶（Hel308、MTA、φ29聚合酶）处理连DNA手柄的肽经MspA孔可区分单位点替换及读取至多17残基，但读长受限于感应区至孔缘距（10–25残基）。蛋白加工马达ClpX（AAA⁺ATP酶）识别ssrA标签机械解折叠并逐步牵扯多肽过孔（含兼容MinION设备顺式加ClpX方案），用PASTOR序列与机器学习可分类氨基酸替换及重读提升准确率，亦演示读折叠蛋白；蛋白酶体–纳米孔融合(Proteasome–Nanopore Fusion)可递完整多肽或6–10肽片段。局限为需末端标签（ssrA或非天然氨基酸）及统一标记复杂样本困难。

CONCLUSIONS AND FUTURE OUTLOOK（结论与展望）

蛋白质测序与蛋白质指纹(Protein Fingerprinting)为互补策略，高通量指纹初筛联合测序深析可推进蛋白质组学。Erisyon荧光测序适于异质混合Proteoform指纹比对数据库，但受限于数据库依赖与标记种类；Quantum-Si倾向部分N端从头读与变异检测，识别子持续扩展中；Nautilus数字化定量Proteoform可正交整合；纳米孔具线性化与酶控转运潜力，需进一步提升单氨基酸分辨——含孔工程/功能化、进程性马达及通用末端标记化学；新兴另类法含逆转录-Edman-DNA条码、DNA-PAINT、FRET via DNA交换及量子隧穿。MS仍为金标准但有低丰度物种与多位点PTM组合检测短板，新兴单分子荧光与纳米孔技术填补空白，共筑扩展的蛋白质测序工具箱。

四、讨论与结论翻译

蛋白质测序与蛋白质指纹是互补途径，联用可更深准解析序列–功能关系、基因组偏差及系统蛋白丰度与多样性。高通量指纹快速初筛结合测序厘清歧义可支撑大规模蛋白质组学。Edman降解与MS奠基现代蛋白质组学，新技术正逐步实现实时从头分析、单分子灵敏度及更全面Proteoform检测。综述强调Erisyon荧光测序可通过参考数据库指纹鉴定异质混合与Proteoform但受数据库匹配及稀疏标记制约；Quantum-Si面向部分N端从头读取与变体检测，识别子正向完整20氨基酸拓展；Nautilus专注数字化Proteoform指纹与单分子定量可整合正交平台；纳米孔具线性化与酶控转运潜能，需改进固态/生物孔实现单氨基酸分辨，杂交孔与De Novo设计跨膜孔为方向，稳健单分子从头测序还需孔敏化/功能化及进程马达，通用C/N端标记化学将起关键作用。超越成熟平台，逆转录-Edman-DNA条码、DNA-PAINT、FRET via DNA交换及量子隧穿等早期方法展现单分子分辨创意策略。MS仍为大规模蛋白质组学金标准，新兴技术互补而非替代——MS难测低丰度种与长链多位PTM组合，纳米孔单分子水平配合通量提升可揭示同分子PTM组合功能影响，荧光平台助Proteoform与PTM分析，纳米孔具De Novo单分子测序与PTM检测潜力，共同拓展蛋白质测序工具包。