单细胞蛋白质组学技术：探寻生物学原理的工具

《Annual Review of Biophysics》：Single-Cell Proteomic Technologies: Tools in the Quest for Principles

　　

在过去十年间，单细胞质谱蛋白质组学从一项不确定的可能性发展为一套稳健且快速推进的技术体系，能够支持对数千种蛋白质进行准确定量。研究人员回顾了推动这一进展的主要驱动因素，从可行性确立到强大且日益可扩展的方法。其重点聚焦于不同技术解决方案在统一概念框架内的权衡与协同效应，该框架预示了通量扩展和将分析范围拓展至功能蛋白质测量的巨大空间。研究人员强调这些技术在支持机制性生物物理模型发展以及帮助揭示新原理方面的潜力。

**单细胞蛋白质组学的技术演进与机制推断**

**研究背景与问题**

在过去十年中，单细胞分析领域一直被基于核酸的分析方法所主导，尤其是单细胞转录组学（如单细胞RNA测序）和基因组学，这些方法支撑了细胞异质性的表征和新细胞状态的发现。然而，这些以核酸为中心的方法仅能提供细胞生物学的不完整图景，因为RNA水平只是蛋白质活性或表型的间接替代指标。事实上，蛋白质降解是决定许多蛋白质丰度的主导因素，尤其在细胞生长速率较慢时。此外，细胞行为依赖于仅能通过直接蛋白质测量确定的蛋白质翻译后修饰（Post-translational modifications, PTMs)，如调控性蛋白水解、结合相互作用和亚细胞定位等。因此，学界日益认识到单细胞分析必须超越基因组和转录组，扩展至包括蛋白质在内的其他生物分子的直接测量。

直接蛋白质分析对于理解分子机制和细胞表型至关重要，因为其决定了蛋白质丰度、酶活性、亚细胞定位和构象动态。然而，实现全面的单细胞蛋白质组测量仍面临技术性挑战。传统单细胞蛋白质检测方法（如流式细胞术、质谱流式或DNA编码抗体 panel)通常仅能检测每个细胞几十种蛋白质，且常受限于抗体特异性不足。此外，蛋白质浓度跨越巨大的动态范围（从约1到10⁷拷贝/细胞），这对所有方法均构成挑战，尤其对单分子蛋白质组学而言，并限制了许多低丰度蛋白质的检测。这些局限性凸显了继续推进方法学发展以克服单细胞蛋白质组准确定量、全面检测和可扩展性量化所面临的严峻挑战的紧迫需求。

**研究开展与核心结论**

该综述系统回顾了质谱蛋白质组学在单细胞分析领域的重大进展，展示了如何从技术可行性确立到强大且可扩展的方法体系构建的完整弧线。研究人员重点分析了不同技术解决方案在统一概念框架内的权衡与协同，指出该领域在通量扩展和功能蛋白质测量方面具有可观的发展空间。论文强调，这些技术有望支持机制性生物物理模型的发展并帮助揭示新的生物学原理，发表于《Annual Review of Biophysics》。

**关键技术方法**

研究人员为开展此项综述所涉及的核心技术方法包括：多孔板、微芯片、玻璃片和微流控系统四类样品制备平台；基于低流速的高效液相色谱（Low-flow nanoLC)和毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE)的肽段分离技术；数据依赖型采集（Data-Dependent Acquisition, DDA)和数据非依赖型采集（Data-Independent Acquisition, DIA)及其实时智能控制策略，包括优先化单细胞蛋白质组学（Prioritized single-cell proteomics, pSCoPE)和实时搜索（Real-Time Search, RTS)；质谱平台方面涵盖timsTOF（捕集离子迁移谱-平行累积连续碎裂，PASEF)和Orbitrap Astral等新型仪器；等压标签（如TMTpro）和同位素载体（Carrier)辅助的定量策略；以及基于timsTOF Ultra和Orbitrap Astral的高通量深度覆盖方案。样本队列来源包括HeLa细胞系、小鼠和人类原代组织细胞等。

**研究结果**

**样品制备与肽段分离**

**多孔板法**：多孔板（如96孔或384孔板）提供易于获取的单细胞蛋白质组学样品制备平台。典型流程是将单个细胞分选 albeit 至各孔，所有蛋白质组处理步骤（细胞裂解、蛋白质消化、可选的等压标记）均在同一孔中完成。体积保持在微升级（约1-10 μL）以减少导致蛋白质损失的表面和稀释。最小蛋白质组样品制备（minimal proteomic sample preparation, mPOP)协议采用纯水中冻融裂解，避免使用去污剂或变性剂，从而无需纯化步骤并减少肽段接触表面，降低吸附损失和污染风险。这些方法的固有多细胞并行处理能力约为数百个单细胞。

**微芯片法**：微加工芯片平台通过减小表面积和体积改进传统多孔板方法。代表技术nanodroplet processing in one pot for trace samples (nanoPOTS)使用光刻图案化的玻璃芯片，包含约200 nL或更小的纳升孔，将单个细胞沉积其中进行裂解。通过将整个样品制备限制在小体积内，nanoPOTS实现了从仅1-100个细胞中回收和鉴定蛋白质的提升。其最新迭代嵌套式nanoPOTS芯片（Nested nanoPOTS chip, N²）进一步将反应体积缩小至每孔<30 nL。N²设计将多个微小孔嵌套在较大液滴下：每个单细胞消化液在其纳升孔中标记等压标签后，顶部添加的微升级液滴可同时汇集该簇所有孔便于收集。另一代表为商品化微加工聚四氟乙烯芯片proteoCHIP，采用96孔格式锥形孔阵列，预填充惰性油覆盖层；消化（及如多路复用时的标记）后，孔内容物可转移分析。

**玻璃片基液滴阵列法**：玻璃片法使用开放表面而非固定孔来排列纳升级液滴，从而提高通量和灵活性。纳米级蛋白质组样品处理（nPOP)使用特殊涂层的显微镜载片作为平台，上面以阵列形式分配数千个微小反应液滴。全自动分液系统（CellenONE）将单个细胞沉积在约10-20 nL的二甲基亚砜（DMSO）液滴中。这种开放格式提供空间自由度，可设计任意大小或分组的液滴阵列以适应多路复用方案。Leduc等展示了29重设计：29个单细胞液滴（各 destined for不同TMTpro标签）邻近放置为一个簇，单次nPOP运行可在四张载片上同时制备3,584个单细胞。玻璃片平台通量目前主要受分液速度（约2小时）限制。

**微流控集成系统**：微流控系统通过微尺度流体通道、腔室和阀门（常用聚二甲基硅氧烷，PDMS）或电润湿数字芯片，将整个样品制备流程集成在封闭微装置内。SciProChip使用双层PDMS微流控芯片，具有微阀控制的流道，用于细胞分离、裂解、消化、芯片上固相萃取纯化和收集。数字微流体则使用静电力在电极阵列上操控离散液滴。微流控平台提供全自动化封闭环境，但目前并行度显著低于玻璃片法，且面临试剂兼容性挑战（有机溶剂可使PDMS溶胀或干扰液滴驱动）。

**减少伪影**：所有样品制备方法的重要目标是最小化伪影，包括细胞分离或储存导致的生理变化、细胞通透化和裂解或消化效率变化。蛋白质从细胞中泄漏的问题尤为关键，因其系统性影响功能相关蛋白质组，可能被误认为生物学信号。

**肽段分离**：低流速肽段分离技术可提高单细胞蛋白质组学灵敏度。将流速降至低纳升/分钟范围（通过nanoLC或CE分离）可改善电喷雾电离（ESI)效率，产生更细的ESI液滴并减少离子抑制。例如，从300降至20 nL/min可使每分子信号强度提高约5-10倍。然而，窄孔径LC柱（内径20-50 μm）和纳流体系在操作上具有技术挑战性，易堵塞；CE虽灵敏，但存在肽段吸附于毛细管壁和电渗流漂移等重现性问题。目前创新发展包括：整体柱和纳米开管柱等新柱格式、化学涂层毛细管、在线预浓缩技术，以及双柱nanoLC等多路低流速系统。

**数据采集与分析**

**提高离子利用效率**：通过更宽的前体离子隔离窗口（如plex二者plexDIA方法使用4个宽隔离窗口进行二级质谱（MS2)扫描，允许离子累积时间达约300 ms）、离子迁移分离整合（如timsTOF的PASEF技术，Slice-PASEF连续扫描四极杆 across 迁移率维度），以及高效离子处理和检测（Orbitrap Astral质谱仪的双级分析器设计，使用增强离子光学和大容量漏斗，实现高效离子传输）等策略提升灵敏度。

**智能数据采集**：实时控制MS采集策略可智能引导数据采集以提高肽段鉴定、数据完整性和蛋白质组覆盖深度。MaxQuant.Live与Orbitrap仪器接口，基于实测保留时间调整MS/MS采集参数以检测数千个预设前体。实时搜索（RTS)在Thermo Tribrid Orbitraps上进行飞行动态数据库搜索，线性离子阱快速鉴定肽段序列后触发高级扫描。pSCoPE引入多层优先级排序方案，通过实时保留时间对齐控制数据采集，每个肽段分配优先级水平，使高优先级前体在每轮单细胞运行中被一致选择进行MS/MS，并可累积更长时间以提高灵敏度。该实时优先化使每个细胞定量蛋白质数翻倍，在Q-Exactive经典仪器上达到约1,500种蛋白质/细胞，数据完整性>90%。RTS配合同步前体选择（SPS)-MS³仅在实时鉴定肽段后触发MS³扫描，减少共碎裂干扰和比率压缩。

**使用载体**：等压或同位素载体可缓解单细胞蛋白质拷贝数有限导致的序列鉴定挑战。等压载体使用等压质量标签，使载体与单细胞的肽段片段在每个碎裂谱中汇集，提供更多片段用于序列鉴定。同位素载体则依赖共洗脱和已知质量偏移传播序列鉴定。

**仪器技术进步**：硬件创新通过最大化离子传输、处理、扫描速度和检测能力显著改善深度和灵敏度。Bruker CaptiveSpray Ultra离子源和更新离子漏斗界面提高离子传输效率；timsTOF Ultra的dual-TIMS设计通过PASEF实现高效占空比，配合快速飞行时间分析器和14位数字化仪，实现高MS2扫描速率；Athena Ion Processor（2025年引入）进一步增强MS/MS谱中肽段片段检测灵敏度。Orbitrap Astral采用不对称离子飞行路径和双压力线性离子阱（离子处理器），实现高灵敏度和200 Hz MS/MS通量，label-free单细胞分析可鉴定约5,000个蛋白质组。

**增加通量**

**缩短分离时间**：使用快速梯度（短至2-5分钟）结合DIA，专用LC系统（如Evosep）使用预形成梯度每天运行>100次进样。但减少色谱时间会降低肽段分离效率，损害蛋白质组深度。

**样品多路复用**：TMT试剂（包括TMTpro）允许多达35个样品池化后单次LC-MS/MS运行分析。TMT多路复用已使每个细胞定量超过2,000个蛋白质组；结合短梯度，每天可分析超过1,000个单细胞，定量约1,000种蛋白质/细胞。局限在于仅样品水平多路复用，MS/MS仍逐次选择和碎裂前体，且共隔离影响定量准确性。

**样品与肽段同时多路复用**：mass域多路复用（plexDIA）使用非等压质量标签以不同质荷比偏移编码各样品，已用mTRAQ、二甲基、二乙基和PSMtags等实现。PSMtags通过增加检测肽段片段增强序列鉴定，支持5重（4 Da偏移）或9重（2 Da偏移）多路复用，9重样品30分钟梯度可定量>3,000种蛋白质/样品。time域多路复用（timePlex）通过时间偏移编码样品，多路 staggered 进样使活性梯度交错但保持可区分。timePlex与plexDIA结合：3-timePlex × 9-plexDIA = 27-plexDIA，每天可处理>500样品，路径清晰可达>1,000细胞/天。

**机制推断**

**统计关联与生物物理因果性**：单细胞组学数据常引发统计或机器学习方法寻找关联，但关联不等于因果。混杂变量和间接效应可产生虚假关联；即使无限观测数据，纯统计方法也可能因基本歧义而无法确定真正因果驱动因素。机制性生物物理模型则整合已知化学和物理原理（结合亲和力、酶动力学、信号通路）建模系统行为。这类模型的优势在于可推广性：基于真实因果机制的模型即使在条件变化时仍成立， whereas 统计模型可能失效。例如，共表达网络可能无法预测药物处理细胞的情况，但信号通路的机制模型可以，因其编码了干预下仍持续的因果关系。

**条件化混杂因子**：发展机制模型需要相关变量的可靠直接测量，这正是单细胞蛋白质组学的贡献所在。单细胞蛋白质组测量可精确可靠地计数每个细胞数百至数千拷贝，量化实际效应物和信号分子，使超越关联的因果推理工具更易应用。例如，早期单细胞蛋白质组学数据已提供证据：转录因子丰度（如P53）与其转录本不同，与其靶转录本丰度相关。统计推断中转录因子蛋白数据可约束模型至生物学合理的直接相互作用，而非间接转录本-转录本相关性。条件化混杂因子时测量准确性至关重要，因测量噪声可能引入而非消除虚假关联；蛋白质MS方法可采样数百至数千拷贝/细胞，优于单细胞RNA测序的少量拷贝采样。

**观察特定扰动的即时响应**：确定性因果推断需观察系统对靶向扰动的响应。扰动需特异性作用于已知蛋白而非泛化（如靶点未知的药物）；响应需在扰动后快速测量，因延迟响应可能包含甚至由间接次级效应主导。有前景的方向包括靶向蛋白质降解后快速进行单细胞MS分析。即使靶向扰动，缺失数据仍可能导致与冲突机制一致的调控模型，因此需要模型网络中所有蛋白质变体（proteoforms）的全面定量。

**新兴原理与功能推断**：近期蛋白质丰度调控模型已提示推定原理。Leduc等建模了合成速率和降解速率对数千种蛋白质在数千个小鼠气管单细胞中控制蛋白质丰度的贡献，结果提示翻译和蛋白质降解的调控影响与细胞生长速率呈显著线性缩放：生长速率越高，翻译调控贡献越高，蛋白质降解调控贡献越低。这种降解影响的降低可由快速生长时蛋白质稀释作为主导清除模式的机制解释。该机制的识别得益于本综述评述的方法，凸显其未来潜力。该研究还强调了受调控蛋白质合成和降解对单细胞蛋白质组及蛋白质联合分布的形成性影响；这些联合分布是因果推断的基础，其准确估计对因果推断至关重要。

**研究结论**

在过去十年中，单细胞MS蛋白质分析已从怀疑领域转变为稳健证实且积极发展的研究领域。该领域有诸多明确的技术进步目标，如增加蛋白质分析的通量和深度，提高PTMs定量的范围和准确性。虽然可变搜索PTM从一开始就鉴定PTM，但专注方法（如优先化数据采集或spike-in肽段）可增加PTM分析范围和准确性。更多技术和方法发展仍需扩展PTM定量和蛋白质活性的广度与一致性，以实现上述机制性生物物理模型。

单细胞蛋白质组学的生物学应用从一开始就用于研究细胞命运转变、巨噬细胞极化、细胞谱系层级和药物抗性等。然而，生物学驱动研究的全面实现通常落后于技术能力。因此，该领域的主要机遇是使技术更易获取、更好整合入更广泛社群以实现多样化研究目标，包括本文倡导的机制性生物物理模型。当与精心设计的扰动实验结合时，单细胞蛋白质组学可提供绘制因果机制的 exceptionally 强有力途径：扰动蛋白质活性并直接观察每个细胞中的下游蛋白质水平效应，以分子分辨率连接因果。这种机制性测量与扰动验证的协同可能是构建可靠因果生物学模型甚至发现新原理的金标准。