基于超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS）联用多数据库筛选与特征分子网络技术对泻白散汤剂进行植物化学表征的综合注释策略研究

《Frontiers in Chemistry》：An integrated annotation strategy for the phytochemical characterization of Xie-Bai-San decoction based on UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS, multi-database screening, and feature-based molecular networking

　　

植物衍生化合物在复杂植物制剂中的表征仍具挑战性，原因在于基质复杂、结构类似物众多以及异构现象频发。泻白散（XBSD）是一种由桑白皮、地骨皮和甘草根及根茎组成的传统中药复方，属于需要全面植物化学表征的复杂植物体系。本研究建立了一种整合的植物化学注释策略，采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS），并结合自动化数据处理流程，该流程整合了自建库、公共数据库以及特征分子网络（FBMN）技术。化合物表征进一步通过对照标准品验证、串联质谱（MS/MS）图谱解析、文献比对以及置信度分级予以支持。在泻白散中共注释或推测表征了218个化合物，包括80个黄酮类、35个有机酸类、23个酰胺类、21个萜类、17个香豆素类、8个糖类、6个生物碱类、5个茋类、3个环肽类以及20个其他成分。其中，74个化合物为首次在泻白散中报道，13个化合物通过与 authentic reference standards 比对得到了明确鉴定。研究人员阐释了代表性的MS/MS碎裂特征，以指导结构相关类似物的注释。FBMN实现了分子家族的可视化聚类，促进了快速结构推断，并提高了类似物注释的置信度，尤其对于异构体及低丰度化合物而言。

泻白散作为经典中药复方，始载于宋代《小儿药证直诀》，由桑白皮（桑科植物桑的干燥根皮）、地骨皮（茄科植物枸杞或宁夏枸杞的干燥根皮）及甘草（豆科植物甘草的干燥根和根茎）组成，临床长期用于治疗咳嗽、气喘及"肺热"相关呼吸系统疾病，尤多用于儿科患者。现代研究亦证实其具有抗炎及肺保护作用。尽管该方剂临床应用历史悠久且药理相关性明确，但其整体化学组成，尤其是结构相关异构体及低丰度成分，尚未得到系统表征。针对复杂植物制剂中植物衍生化合物全面表征的迫切需求，研究人员开展了此项研究。

目前，系统植物化学分析面临多重挑战：这类基质通常含有结构多样的成分，包括黄酮类、酚酸类、香豆素类、萜类、生物碱类、酰胺类及其他代谢物，分布于广泛的极性和丰度范围；结构相关类似物、位置异构体及低丰度化合物的频繁出现显著增加了准确注释的难度。尽管液相色谱联用高分辨质谱（LC–HRMS）已成为植物化学研究的有力工具，但化合物注释仍高度依赖MS/MS碎裂图谱的人工解析，劳动密集且难以区分结构相关代谢物及异构体。基于特征分子网络（FBMN）的策略通过按谱图相似性组织MS/MS数据，实现分子家族的可视化并促进结构相关代谢物的发现，为高分辨质谱与多数据库筛选的有机结合提供了有前景的分析框架。

研究人员发表于《Frontiers in Chemistry》的此项研究，旨在建立整合分析策略以实现泻白散的全面植物化学表征。研究结论表明：该工作为泻白散提供了系统性化学表征，拓展了对其成分组成的认识，为未来药理学活性及质量评价研究提供了重要的化学基础；同时证明了光谱资源与网络分析相结合在研究传统中药复方中的实用价值，并为其他复杂植物制剂的化学研究提供了可扩展的框架。

开展此项研究所用的主要关键技术方法包括：样本制备方面，泻白散饮片按标准配方加水煎煮、浓缩并干燥得到提取物，取适量以50%甲醇回流提取后进行分析；核心分析平台为超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS），色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱（150 mm × 2.1 mm, 1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，质谱采用加热电喷雾离子源正负双模式，应用高能碰撞解离（HCD）在20、40和60 eV能量下获得MS/MS数据；数据处理方面，通过Compound Discoverer进行峰检测、保留时间对齐、背景扣除和质量校正，实施多层级鉴定工作流，依次匹配mzCloud、本地mzVault库（含标准品光谱）、OTCML和MassBank数据库，并以ChemSpider辅助结构查询，结合特征碎片离子和MzLogic子结构排序优化结构归属；特征分子网络构建方面，原始数据经MSConvert转换为mzXML格式，经MZmine进行峰检测、保留时间对齐、特征反卷积和同位素/加合物分组后，上传至GNPS平台进行FBMN分析，最终以Cytoscape可视化，网络参数设定最小余弦相似度0.7、最小匹配碎片离子数6、topK值为10，前体离子和碎片离子质量容忍度均为0.02 Da；结果验证通过Xcalibur提取离子流色谱图并人工检验（5 ppm质量容忍窗口）完成以排除假阳性。

研究结果部分，研究人员按照以下体系展开：

化学成分的鉴定工作流。为实现泻白散的全面高置信度表征，研究人员建立了整合自动化谱图匹配、多源数据库检索、FBMN及靶向人工验证的分层鉴定工作流。UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS获取的高分辨MS和MS/MS数据首先在Compound Discoverer中进行特征提取、分子式预测和初步注释；实验MS/MS光谱依次与mzCloud、本地mzVault库及OTCML和MassBank curated条目进行匹配；为提升注释覆盖度和结构区分能力，在GNPS平台实施FBMN，通过按碎裂相似性组织MS/MS光谱实现结构相关特征簇的可视化，促进从已确认"种子"化合物向未知类似物的结构信息传播，该策略对于区分结构异构体和检测低丰度代谢物尤为优势；最终结构归属通过整合精确质量测量（≤5 ppm）、MS/MS碎裂行为、保留特征、分子网络关系及诊断性碎裂路径评估确立。此多级策略显著降低了对人工解析的依赖，同时增强了注释置信度和跨化合物类别的结构一致性。

泻白散的总体化学分析和分子网络分析。依照代谢组学标准倡议（MSI）框架对注释成分进行置信度分级：通过与对照标准品比较保留时间（容忍度±0.05–0.2 min）、精确质量和MS/MS光谱确认的为level 1鉴定；与文献报道、数据库记录及诊断性碎裂行为匹配的为level 2注释；主要基于精确质量、分子式预测及分子家族内结构相似性的为level 3暂定鉴定。据此，共表征218个化学成分，其中13个为level 1（对照标准品明确鉴定）、157个为level 2、48个为level 3；74个化合物为首次在泻白散中报道。正负离子模式高分辨总离子流图显示了泻白散显著的化学复杂性及两种离子化条件下的互补覆盖度。结构上以黄酮类（80个）为主导，另有有机酸类（35个）、酰胺类（23个）、萜类（21个）、香豆素类（17个）、糖类（8个）、生物碱类（6个）、茋类（5个）、环肽类（3个）及20个其他微量成分。FBMN分析中，相同或密切相关结构的化合物形成离散子网络，实现分子家族可视化并促进异构体和结构相关成分的识别。

黄酮类化合物的鉴定。黄酮类为植物次生代谢物中最大且最多样的一类，具有C6–C3–C6骨架。共表征80个黄酮类相关成分，按结构属性分为O-糖苷化黄酮、C-糖苷及其相应苷元。

黄酮类O-糖苷及相关苷元：黄酮类O-糖苷以糖单元通过C–O键与苷元连接为特征，碎裂通常始于糖苷键断裂。单糖苷优先失去己糖单元（162 Da）产生苷元离子，双糖苷则经历糖残基的逐步中性丢失。所得苷元进一步通过特征性中性丢失（如CH₃、CO、H₂O）和逆狄尔斯-阿尔德（RDA）裂解产生指示黄酮亚类的诊断性离子。以化合物118（t_R 28.56BitoHRMS数据（C₂₆H₃₀O₁₃，–3.90 ppm）结合文献比对，化合物118被推定为甘草苷-apioside；化合物138通过对照标准品明确鉴定为芒柄花素（ononin）；化合物141通过对照标准品明确鉴定为甘草苷（liquiritin）。FBMN聚类分析中，节点#5360、#6455、#6242和#6381（对应化合物115、145、141和136）归为同一家族，共享质荷比417 [M–H]^–但保留时间不同，提示异构现象，其中节点#6242（化合物141）通过对照标准品确认为甘草苷，其余节点基于GNPS匹配、HRMS数据、碎裂模式和文献推定为异甘草苷（isoliquiritin）、新异甘草苷（neoisoliquiritin）和新甘草苷（neoliquiritin）。另一簇节点#5525、#5424和#5255中，节点#5424和#5525均呈现m/z 255 [M–H]^–，分别推定为异甘草苷元（isoliquiritigenin）和甘草苷元（liquiritigenin），节点#5255质量差2 Da，鉴定为7,4'-二羟基黄酮。

黄酮C-糖苷的结构表征和碎裂行为：共表征7个黄酮C-糖苷。由于C–C糖苷键的稳定性，直接糖丢失未观察到，碎裂以糖环内交叉环裂解为主导，为糖鉴定提供诊断性中性丢失。己糖C-糖苷表现典型的60、90和120 Da中性丢失，戊糖C-糖苷则主要表现60和90 Da丢失。FBMN显示若干独立C-糖苷簇：节点#4974和#5419形成一簇，质量差14 Da（–CH₂），注释为vicenin-III和schaftoside；另一簇节点#4244和#4300高度相似的MS/MS光谱注释为牡荆素（vitexin）和异牡荆素（isovitexin），节点#3157呈+16 Da位移（额外羟基取代），注释为葛根素（puerarin）。以化合物104（t_R 26.28 min）为例，其负离子模式下准分子离子为m/z 563.1412 [M-H]^–（C₂₆H₂₈O₁₄，2.19 ppm），碎裂始于己糖A环的0,2-交叉环裂解（–120 Da）产生m/z 443.0989，继而戊糖B环0,3-交叉环裂解（–60 Da）产生m/z 383.0777；亦存在戊糖先0,2-交叉环裂解（–90 Da）产生m/z 473.1093，再己糖0,2-交叉环裂解（–120 Da）产生m/z 353.0671的替代路径，该离子进一步连续CO消除。据此化合物104注释为vicenin-3。

茋类化合物的鉴定。茋类为植物衍生多酚，以1,2-二苯乙烯（C6–C2–C6）骨架为特征。桑白皮含茋类如桑皮苷A、氧化白藜芦醇及其多糖苷，为桑科的重要活性成分。共表征5个茋类，包括氧化白藜芦醇、桑皮苷A、白藜芦醇、氧化白藜芦醇-3-O-β-葡萄糖苷及其异构体。负离子模式下这些化合物表现一致的碎裂路径：糖苷化衍生物首先经历己糖单元中性丢失（–162 Da）产生相应苷元离子，随后从苷元发生H₂O（–18 Da）、CO（–28 Da）、CO₂（–44 Da）和CH₂O（–30 Da）的连续或竞争性消除，产生茋类骨架的诊断性离子m/z 225和243。以化合物70（t_R 16.39 min）为例，其去质子化分子离子[M-H]^–为m/z 567.1725（C₂₆H₃₂O₁₄，3.03 ppm），MS/MS中前体离子连续丢失两个葡萄糖残基（各–162 Da）产生m/z 405.1197 [M-H-Glc]^–和m/z 243.0663 [M-H-2Glc]^–，苷元离子进一步发生典型茋类碎裂产生m/z 225.0556（–H₂O）、215.0707（–CO）和199.0760（–CO₂）。结合对照标准品保留时间匹配，化合物70确认为桑皮苷A。

有机酸类化合物的鉴定。有机酸类为广泛存在于植物衍生食品中的低分子量代谢物。共表征35个有机酸类，包括脂肪族酸、奎宁酸衍生物、氨基酸、酚酸及一种芳香酸，其中绿原酸（化合物64）和咖啡酸（化合物79）通过对照标准品直接比对明确鉴定。FBMN揭示了有机酸类内的若干分子家族：节点#550和#376共享相同前体离子和高度相似的MS/MS光谱，支持异构体关系；节点#4744质量差4 Da，综合GNPS匹配结果、高分辨质量数据和碎裂行为，分别注释为柠檬酸、异柠檬酸和壬二酸。另一簇节点#4894、#4604和#2667中，节点#4894和#4604呈相同前体离子m/z 515和几乎相同的MS/MS光谱，指示为异构的二咖啡酰奎宁酸，节点#2667质量增加162 Da与葡萄糖基取代一致，分别注释为cynarine、异绿原酸B和隐绿原酸。以化合物133（t_R 32.85 min）为例，其去质子化分子离子m/z 515.1202 [M-H]^–（C₂₅H₂₄O₁₂，3.58 ppm），HCD条件下产生m/z 353.0883、173.0447和135.0440的显著碎片离子，对应咖啡酰基和奎宁酸部分的逐步裂解，与cynarine的文献报道数据一致。

萜类化合物的鉴定。共表征21个萜类，包括19个三萜、1个倍半萜和1个单萜。MS分析中这些化合物主要特征为葡萄糖醛酸基团的连续中性丢失及苷元脱水。化合物165（t_R 37.51 min）和167（t_R 37.87 min）在FBMN中聚类为同一分子家族，前体离子质量差16 Da对应一个额外氧原子，GNPS匹配初步推定为glycyrrhizin G2和甘草酸（glycyrrhizic acid）。正离子模式下，化合物165呈现质子化分子离子m/z 839.4055 [M+H]⁺（C₄₂H₆₂O₁₇），化合物167为m/z 823.4106 [M+H]⁺（C₄₂H₆₂O₁₆）。HCD条件下两者表现类似碎裂路径：首先丢失一个葡萄糖醛酸单元（–176 Da），继而丢失第二个葡萄糖醛酸（–352 Da），后续碎裂模式出现分歧。化合物167通过对照标准品明确鉴定为甘草酸，化合物165基于MS/MS碎裂特征和文献数据注释为glycyrrhizin G2。

酰胺类化合物的鉴定。共鉴定23个酰胺类，包括10个亚精胺型、4个腐胺型、2个尸胺型、5个其他酚酰胺和2个非酚酰胺。FBMN将节点#6439、#2249和#6518聚类为同一分子家族，GNPS注释分别为N-香豆酰酪胺、(E)-N-咖啡酰腐胺和N-阿魏酰酪胺，并由HRMS测量和MS/MS碎裂数据支持。对于亚精胺型和精胺型酚酰胺，碎裂特征为酰胺键初始裂解后继之多胺骨架的逐步降解。化合物52（t_R 14.07 min）显示质子化分子离子[M+H]⁺为m/z 531.3175（C₂₈H₄₂N₄O₆，–0.40 ppm），MS/MS中前体离子经历C₁₂H₁₅NO₃（221 Da）丢失，继而连续丢失17 Da和71 Da，产生m/z 293.1858和222.1125等碎片离子，通过对照标准品明确鉴定为kukoamine B。

香豆素类化合物的鉴定。共注释17个香豆素类。MS分析中这些化合物通常表现取代基的初始中性丢失，如糖苷裂解（–162 Da）或脱甲基（–15 Da），继而从香豆素核心发生特征性的逐步CO（28 Da）和CO₂（44 Da）丢失，提供关键诊断信息。化合物73和106被选为示例：化合物73（t_R 17.01 min）显示[M–H]^–离子m/z 177.0186（C₉H₆O₄，1.89 ppm），MS/MS表现m/z 149.0233 [M-H-CO]^–、133.0283 [M-H-CO₂]^–、105.0333 [M-H-CO₂-CO]^–和89.0383 [M-H-2CO₂]^–，与对照标准品比较确认为七叶内酯（esculetin）；化合物106（t_R 26.47 min）显示[M–H]^–离子m/z 191.0344（C₁₀H₈O₄，2.59 ppm），特征离子包括m/z 176.0107 [M-H-CH₃]^–等，推定为东莨菪内酯（scopoletin）。

糖类化合物的鉴定。糖类在复杂天然产物中的鉴定因其高度结构相似性和异构体多样性而具挑战性。FBMN系统表征了8个糖类，分析显示节点#272、#215、#204、#249、#208和#207归为同一分子家族，提示高度相似的前体离子和MS/MS碎裂模式。化合物18（t_R 1.41 min）显示优势离子[M+H-H₂O]⁺为m/z 325.1125（C₁₂H₂₂O₁₁，–0.40 ppm），MS/MS表现特征碎片m/z 163.0603 [M+H-H₂O-Glc]⁺、145.0494 [M+H-Glc-2H₂O]⁺、127.0391 [M+H-Glc-3H₂O]⁺和85.0290 [M+H-Glc-3H₂O-CO₂]⁺，基于诊断性碎裂行为和文献比对注释为蔗糖（sucrose）。化合物17（m/z 343.1232 [M+H]⁺）和8（m/z 325.1124 [M+H-H₂O]⁺）共享分子式C₁₂H₂₂O₁₁，与蔗糖高度相似的MS/MS光谱，分别注释为乳果糖（lactulose）和D-半乳糖醛酸（D-galaturonate）。化合物9和10的m/z差162 Da指示己糖残基添加，聚合度差异支持分别注释为麦芽三糖（maltotriose）和麦芽四糖（maltotetraose）。正离子模式下糖类表现一致的碎裂路径：初始脱水形成[M+H-H₂O]⁺离子，继之发生葡萄糖单元的0,2A^–、2,4A^–和B型裂解，产生m/z 145（C₆H₉O₄⁺）、127（C₆H₇O₃⁺）和85（C₄H₅O₂⁺）等主导碎片离子，解释了其在FBMN分析中聚类为单一分子家族的原因。

生物碱类化合物的鉴定。共表征6个生物碱类，包括3个N-季铵生物碱（甜菜碱、葫芦巴碱和N-甲基天麻素）、1个脂肪胺生物碱（组胺）、1个多羟基生物碱（1-脱氧野尻霉素）和1个芳香羟基生物碱（2-羟基喹啉）。化合物14和3被选为代表性化合物阐明不同亚类的碎裂行为：化合物14（t_R 1.37 min）表现N-季铵生物碱的特征碎裂，直接脱羧（–44 Da）产生基峰m/z 94.0656（C₆H₈N⁺），后续CO丢失（–28 Da）产生m/z 110.0603，进一步HCN消除（–27 Da）产生m/z 67.0550，与葫芦巴碱（trigonelline）的报道MS行为一致；化合物3（t_R 1.12 min）显示[M+H]⁺为m/z 164.0917（C₆H₁₃NO₄，–0.15 ppm），MS/MS特征为连续脱水，产生m/z 146.0813 [M+H-H₂O]⁺、128.0708 [M+H-2H₂O]⁺和110.0604 [M+H-3H₂O]⁺，为多羟基取代的特征，支持其注释为1-脱氧野尻霉素。

环肽类化合物的鉴定。环肽以头尾环化骨架为特征，相较于线性对应物具有增强的代谢稳定性和多样的生物活性。共表征3个环肽，即lyciumin B、lyciumin A和lyciumin D。电喷雾质谱中这些化合物表现一致的诊断性碎裂：酰胺键裂解、环四肽骨架苏氨酸残基的甲醛中性丢失（–30 Da）、以及特征性的脯氨酸二肽单元丢失（–208 Da）。以化合物155（t_R 36.34 min）为例，其显示[M-H]^–离子m/z 962.4075（C₄₉H₅₇N₉O₁₂，3.18 ppm），MS/MS碎裂主要经由两条路径：前体离子丢失208 Da产生m/z 754.3217，继而HCHO丢失（–30 Da）产生m/z 724.3164；或HCHO直接丢失产生m/z 932.3939；酰胺键裂解产生互补离子m/z 591.2485和387.1683，前者进一步丢失30 Da形成m/z 561.2472。这些碎裂特征与lyciumin D的报道MS行为一致，据此化合物155注释为lyciumin D。

讨论部分，研究人员指出本研究揭示了泻白散化学 diversity 的成分谱，以黄酮类为主导，其后依次为有机酸类、酰胺类和萜类，反映了组方药材的植物化学贡献：桑白皮贡献黄酮类和茋类，地骨皮贡献酚酰胺类和环肽类，甘草贡献甘草苷型黄酮类和三萜皂苷类。由此，表征的成分谱为理解泻白散的物质基础提供了有用的药材溯源信息。

从分析学角度，大量糖苷、结构相关类似物和位置异构体的共存对可靠注释仍具挑战性。本工作的创新性并非单独使用LC-HRMS或FBMN，而是将对照标准品、自建数据库、中药相关数据库、文献辅助MS/MS解析和基于FBMN的分子家族分析整合到基于置信度分级的工作流程中。该策略促进了从已确认"种子"化合物向未知类似物和异构体的结构信息传播，改善了单独数据库检索难以解析的结构相关成分的注释。

利用该工作流程，共表征218个成分，包括74个首次在该方剂中报道的化合物。为提升定性注释的可靠性和透明度，研究人员通过HPLC定量主要标志化合物后进行了HRMS分析，并采用峰面积阈值≥100,000、质量精度5 ppm以内的特征过滤，所有注释均基于Xcalibur中的MS/MS碎裂模式进行了人工核查，注释成分进一步按MSI框架分配至不同置信度等级。

然而，本研究仍为定性植物化学分析而非定量代谢组学调查，未包含分析重复进样和混合质控样品，故未计算峰面积RSD等特征水平重现性参数。此外，尽管50分钟UPLC梯度有助于确保广泛的化学覆盖度、可接受的峰形以及低丰度或异构化合物充足的MS/MS采集，但未针对高通量分析优化。未来工作应纳入重复进样、混合质控样品、扩展对照标准品、定量验证和进一步优化梯度，以提升分析重现性、结构分辨能力和通量。

结论部分，研究人员的总结性陈述为："总之，本研究为泻白散提供了系统性化学表征，拓展了对其成分组成的现有认识。结果为未来药理学活性和质量评价研究提供了重要的化学基础。此外，本工作证明了光谱资源与网络分析相结合在研究传统中药复方中的实用价值，并为其他复杂植物制剂的化学研究提供了可扩展的框架。"