《Journal of Chromatography Open》：Classification of honey samples produced in urban areas of the city of Vienna employing comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry
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本研究采用全二维气相色谱-质谱联用技术（GC×GC-QMS，comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry）对奥地利维也纳市23个不同辖区本地生产的蜂蜜挥发物组（volati
本研究采用全二维气相色谱-质谱联用技术（GC×GC-QMS，comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry）对奥地利维也纳市23个不同辖区本地生产的蜂蜜挥发物组（volatilome）进行解析，以实现其组成差异化和地理 preventive 地理分类。研究人员采用涂覆有二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS，divinylbenzene/Carboxen/polydimethylsiloxane）的固相微萃取（SPME，solid-phase microextraction）纤维对多种挥发性有机化合物（VOCs，volatile organic compounds）进行萃取和富集。样品前处理步骤为：将5 g蜂蜜用NaCl饱和水溶液稀释后，于40°C下孵育5 min，随后在250 rpm搅拌条件下萃取45 min。研究人员在受检蜂蜜样品中共鉴定出361种化合物，并进一步采用无监督和有监督化学计量学工具进行处理。层次聚类分析（HCA，hierarchical clustering analysis）结果显示，来自维也纳市中心及其近郊的样品倾向于聚为一类，而来自外围绿化程度较高辖区的样品则形成另一个独立且特征明显的簇。此外，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，orthogonal partial least squares discriminant analysis）表明样品可依据地理来源实现区分，解释总方差达65.1%。OPLS-DA揭示了两个预设组别之间存在明显的分离趋势，并鉴定出与观察到的分化相关的挥发性特征标志物。
## 研究背景与问题提出
蜂蜜是由蜜蜂（Apis mellifera L.）从花蜜或植物非花部分分泌物（包括植物吸吮昆虫的排泄物）生产的甜味粘稠天然物质，可分为百花蜜（multifloral）和单花蜜（monofloral）。蜂蜜含有约80%天然糖类（主要为葡萄糖和果糖），以及水、氨基酸、酶、维生素和矿物质，同时富含多酚和类黄酮，具有抗氧化、抗炎和抗菌特性。蜂蜜中的少量其他化合物赋予其特征性香气，而不同来源蜂蜜的香气差异促使研究人员将挥发性化合物组成作为评估和验证蜂蜜质量与真实性的重要指标。影响蜂蜜挥发物组成的因素包括蜜源植物品种、植物群、蜂种管理、气候条件、加工方式、包装及储存时间等。传统上一维气相色谱-质谱联用技术（GC-MS，one-dimensional gas chromatography-mass spectrometry）被用于检测蜂蜜中的挥发性有机化合物，但在复杂基质样品分析中，由于共存分析物众多易导致共流出（co-elute），该技术适用性受到限制。全二维气相色谱（GC×GC，comprehensive two-dimensional gas chromatography）技术通过利用两种不同选择性的色谱柱及调节器（modulator）实现连续捕集和周期性再进样，可提供更强的分离能力。GC×GC与质谱联用（GC×GC-MS）已成为复杂样品中挥发物分析的高效技术。样品前处理方面，固相微萃取（SPME，solid-phase microextraction）作为一种微型化萃取技术，具有与气相色谱的良好兼容性、全自动化能力以及简单、高效、快速、无损和无需溶剂的优势，已成为食品分析中研究挥发物的重要工具。尽管SPME在蜂蜜地理溯源和真实性评估中已有应用，但将其用于单一都市区域内蜂蜜样品的地理分类仍是尚待探索的领域。
## 研究设计与核心结论
本研究旨在利用低温调制（cryogenic modulated, CM）-GC×GC-QMS与SPME相结合的技术手段，解析维也纳市23个辖区蜂蜜的挥发物组，并通过化学计量学分析探究样品间的相似性及基于地理区域的分类。研究样品为购自维也纳当地市场的23份蜂蜜（编号S1-S23），每份样品分别产自维也纳市相应辖区。研究人员将辖区按城市化程度划分为两组：第1组（红色）为市中心及内城辖区，第2组（蓝色）为外围绿化程度较高的辖区，绘制成图1展示各辖区及绿地分布。绿色区域分为公园林地（深绿色）和农业用地（浅绿色）。表S1提供了样品的详细描述信息。
## 关键技术方法
本研究采用的核心技术方法包括：（1）SPME萃取技术：使用DVB/CAR/PDMS涂层纤维（50/30 μm，2 cm活性长度，24 ga），结合AOC-5000 Plus自动进样器实现 synchronous 自动化操作；（2）低温调制全二维气相色谱-四极杆质谱联用（CM-GC×GC-QMS）：第一维色谱柱为Rtx-5MS（30 m × 0.25 mm ID，0.25 μm），第二维为Stabilwax?-MS（2 m × 0.15 mm ID，0.15 μm），两柱间以未涂覆毛细管柱（1 m × 0.25 mm ID）形成调制环，采用双级环型低温调制器（ZX-1），调制周期4 s，热喷温度350°C，持续时间250 ms；载气为初始压力61.8 kPa的平流模式运行，程序升温从40°C开始保持5 min，以5°C min
-1升至230°C，再以50°C min
-1升至250°C保持5 min，总分析时间48.40 min；电子电离（EI）模式，离子源温度200°C，接口温度250°C，扫描范围45–445 m/z，扫描速度20,000 amu s
-1，谱图采集频率33 Hz；（3）数据采集与可视化：使用GCMS Solution v.4.85软件进行数据采集，ChromSquare软件ver. 2.3进行二维可视化；（4）化合物鉴定：采用FFNSC 4.0质谱数据库，质量控制标准为质谱相似度≥80%且线性保留指数（LRI）匹配区间±20；（5）化学计量学分析：使用SIMCA软件（v.14.1），数据经均值中心化后进行帕累托缩放（Pareto scaling，ParN），采用Ward法与欧氏距离进行无监督HCA，构建OPLS-DA模型时使用VIP（variable importance in projection，投影变量重要性）算法筛选标志物，临界值设为1.0，并通过七折交叉验证、999次随机置换检验及受试者工作特征曲线（ROC）评估模型性能。
## 研究结果
### 化学计量学结果
研究初始数据矩阵包含23份蜂蜜样品（市中心及近郊10份，外围绿化辖区13份）的双份分析结果，共46个样本和361种挥发性化合物。预处理过程中自动排除高频率零值变量后，数据集减少为314个变量。
### 层次聚类分析结果
无监督HCA树状图清晰呈现两个主要簇，对应两个地理类别。来自维也纳市中心及内辖区的样品倾向于聚为一类，而来自建筑密度较低、绿化程度较高（公园、农业或森林区域）的外辖区的样品形成另一个独立且特征明显的簇。该聚类模式支持蜂蜜挥发性化学成分存在区域差异性。需要指出的是，HCA作为探索性无监督工具用于可视化样品相似性，未使用预设类别信息，因此观察到的聚类模式应视为支持性而非确证性证据。
### 正交偏最小二乘判别分析结果
OPLS-DA模型成功区分了来自维也纳市区和郊区的蜂蜜样品。模型解释总方差为65.1%，分组依据为城市密度和土地利用特征（内城区vs外城区）。尽管存在某些环境相似性，观察到的聚类反映了植物来源和城市暴露的综合效应，因此该分化为多因素作用而非单纯环境因素。选择帕累托缩放而非统一变量缩放（UV）或无缩放，是为了在强调主导信号和保留低丰度变量贡献之间取得平衡。模型表现出较高的解释能力（R2Y = 0.98）和在研究数据集内的表观预测性能（Q2 = 0.81），显示出基于挥发物图谱的清晰分离趋势。然而，由于样本量有限且变量-样本比偏高，这些数值可能导致乐观的性能估计，应谨慎解读。
模型验证采用默认七折交叉验证程序，999次随机置换检验确认了模型的统计显著性。ROC曲线显示OPLS-DA模型能以100%准确率对蜂蜜样品按地理来源分类，曲线下面积（AUC）为1，表明在给定数据集内完全分离。但研究人员明确指出，由于缺乏独立外部验证数据集，模型评估仅依赖内部验证程序，因此当前OPLS-DA结果应视为探索性和假设生成性的，而非确定性预测分类证据，需要更大样本队列和外部验证数据集的确认。
### 标志物化合物鉴定及与前期研究比较
VIP评分突出了40种特定标志化合物（VIP评分 > 1）。其中许多化合物在以往研究中已被鉴定为蜂蜜地理或植物来源的标志物。在城市邻近蜂蜜中相对丰度和/或检测频率较高的化合物，提示存在与城市接近性相关的潜在环境或植物学影响。
萜烯类（terpenes）和单萜类（monoterpenes）化合物，如芳樟醇（linalool）及其氧化物、聚伞花烃（cymene）、萜品烯-4-醇（terpinen-4-ol）、γ-萜品烯（γ-terpinene）、α-萜品烯（α-terpinene）、水芹烯（phellandrene）、马鞭草烯酮（verbenone）、伞花酮（umbellulone）、优葛缕酮（eucarvone）、萜品油烯（terpinolene）、柠檬烯氧化物（limonene oxide）和侧柏-2,4-二烯（thuja-2,4-diene），来源于多花型城市植物群的nectar/pollen。这些萜烯与中心城市公园的多花型花粉呈正相关，在那里建筑密度限制了单花型组成。相比之下，醛类和醇类/烃类化合物指示人为影响，如壬醛（nonanal）和癸醛（decanal）在城市路边空气中普遍存在，因城市交通和排放暴露而在市中心含量升高。
芳樟醇是花卉、草药、木材和叶片中著名的风味成分，是蜂蜜重要的挥发性组分，其衍生物如顺式和反式芳樟醇氧化物是蜂蜜中最常见的萜烯。这些氧化物可能由芳樟醇及其中间体6,7-环氧芳樟醇经环氧化形成，涉及P450羟化作用。壬醛和癸醛是蜂蜜样品中最广泛鉴定的醛类，壬醛呈现醛香、柑橘、脂肪、花香、青香和松木香，癸醛呈现肥皂、橙皮和牛脂香气。辛醇（octanol）和辛烷（octane）也是蜂蜜常见挥发组分，辛烷被确定为潜在蜂蜜植物来源标志物。对伞花烃（p-cymene）在不同蜂蜜样品挥发组分中普遍存在，其含量差异可用于区分不同地理区域和植物来源的蜂蜜。优葛缕酮已在石南蜂蜜、杏仁树蜂蜜、迷迭香蜂蜜和栗树蜂蜜中鉴定，其在栗树蜂蜜中的规律性存在可作为真实性研究潜在标志物。伞花酮也被提出作为椴树蜂蜜的潜在标志物。α-水芹烯在冷杉蜂蜜（Abies honey）中鉴定，为各蜂蜜来源的特征成分。
## 讨论总结与研究结论翻译
研究人员在本研究中对维也纳都市区蜂蜜样品进行了全面的挥发物组表征。CM-GC×GC-QMS与SPME的结合实现了361种不同挥发性有机化合物的鉴定。采用无监督和有监督化学计量学工具评估样品相似性，并识别影响样品按城市地理区域聚类的挥发物标志物。HCA显示，来自维也纳市中心及附近区域的样品紧密聚集，而来自较远郊区的样品形成明显独立的簇。OPLS-DA揭示了内城区与外城区蜂蜜样品之间的分离趋势，并突出了一组可能与观察到的分化相关的挥发性化合物。然而，由于样本量较小，该有监督模型被视为探索性的，需要包含更大数据集的进一步研究来验证其预测性能。共鉴定出40种在城市邻近蜂蜜中更为普遍的具体标志化合物，提示存在与城市接近性相关的潜在环境或植物学影响。部分标志物可与花（即蜜蜂饲料来源）相关，而另一些则可能属于城市环境，这与花粉在蜂蜜生态系统中的多方面作用以及本研究涉及的多领域特性的多维度性质一致。
研究结论（Conclusions）原文翻译如下：
"在本研究中，对维也纳都市区生产的蜂蜜样品的挥发物组进行了全面表征。CM-GC×GC-QMS与SPME的结合实现了361种不同挥发性有机化合物的鉴定。采用无监督和有监督化学计量学工具评估样品相似性，并识别影响样品按城市地理区域聚类的挥发物标志物。HCA显示，来自维也纳市中心及附近区域的样品紧密聚集，而来自较远郊区的样品形成明显独立的簇。OPLS-DA揭示了内城区与外城区蜂蜜样品之间的分离趋势，并突出了一组可能与观察到的分化相关的挥发性化合物。然而，由于样本量较小，该有监督模型被视为探索性的，需要包含更大数据集的进一步研究来验证其预测性能。共鉴定出40种在城市邻近蜂蜜中更为普遍的具体标志化合物，提示存在与城市接近性相关的潜在环境或植物学影响。"
