《International Journal of Molecular Sciences》：Benzovindiflupyr Is Associated with Metabolic Homeostasis Disturbance and Gut–Liver Axis Alterations in Zebrafish: Insights from a Multi-Omics Approach
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摘要：苯并烯氟菌唑(Benzovindiflupyr, BZF)是一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂(Succinate Dehydrogenase Inhibitor, SDHI)类杀菌剂，广泛用于作物保护，但其对非靶标水生生物的潜在影响仍令人担忧。本研究中，研究人
摘要：苯并烯氟菌唑(Benzovindiflupyr, BZF)是一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂(Succinate Dehydrogenase Inhibitor, SDHI)类杀菌剂，广泛用于作物保护，但其对非靶标水生生物的潜在影响仍令人担忧。本研究中，研究人员将成年斑马鱼(Danio rerio)暴露于5.0和50 μg/L BZF中28 d，联合应用微生物组学、生化、组织学和代谢组学分析考察BZF对肠-肝轴(gut–liver axis)的影响。BZF暴露造成肠道结构损伤、屏障相关基因下调及肠道菌群组成改变；同时血清脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)水平升高，提示肠道屏障完整性受损及菌群失调。肝脏中BZF引起组织病理学改变、血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase, AST)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)活性升高、氧化应激增强及炎症相关基因上调。肝脏代谢组学分析进一步显示氧化还原平衡和代谢稳态显著紊乱。相关性分析还揭示改变的微生物类群与差异肝脏代谢物之间存在显著关联。综上，结果表明BZF暴露破坏斑马鱼肠道稳态，并通过肠-肝轴扰动与肝脏代谢紊乱相关联。本研究拓展了对SDHI类杀菌剂毒理效应的认识，为水环境中BZF的生态风险评估提供了有用依据。
论文解读：苯并烯氟菌唑(BZF)暴露致斑马鱼肠-肝轴扰动与肝脏代谢稳态紊乱的多组学研究
一、研究背景与意义
琥珀酸脱氢酶抑制剂(Succinate Dehydrogenase Inhibitor, SDHI)类杀菌剂因广谱高效而广泛应用，苯并烯氟菌唑(Benzovindiflupyr, BZF)是其中代表性品种。BZF在土壤中半衰期较长（15–90 d），低水溶性且光解有限，易残留于水体中对非靶标生物产生风险，欧洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)已将其列为对水生生物高毒。已有研究提示BZF可抑制琥珀酸脱氢酶(SDH)活性、诱导活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成，但其对水生脊椎动物肠道屏障功能、肠道菌群、肝脏代谢及肠-肝轴(gut–liver axis，指肠道微生物、肠屏障与肝脏间的双向通讯网络，参与维持代谢稳态)整体稳态的影响尚不清楚。鉴于此，研究人员以遗传背景清晰的模式生物斑马鱼(Danio rerio)为对象，采用多组学联用策略探究BZF亚急性暴露对肠-肝轴的毒性效应及机制。该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
二、主要关键技术方法
研究人员选用4月龄AB系成年斑马鱼，设溶剂对照组（丙酮终浓度0.001%）、5.0 μg/L（环境相关低剂量，L-BZF）和50 μg/L（高剂量，H-BZF）BZF处理组，每日换液维持暴露浓度，持续28 d（n=6缸/组，15尾/缸）。主要技术手段包括：计算肝体指数(Hepatosomatic Index, HSI)与肠体指数(Intestine Somatic Index, ISI)；石蜡切片进行肠道与肝脏组织病理学检查及杯状细胞计数；商业化试剂盒测定血清ALT、AST、ALP及LPS水平，检测肠道与肝脏组织超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)；基于16S rRNA基因扩增测序分析肠道内容物菌群α/β多样性及分类组成（Random Forest与LEfSe分析）；基于1H核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, 1H NMR)的代谢组学结合KEGG通路富集鉴定肝脏差异代谢物；qRT-PCR检测肝脏炎症信号基因（tlr4ba、myd88、traf6、nfκb、tnf-α、lbp）与肠道屏障基因（muc2.1、muc5.1、claudin 1、zo-1）；Pearson相关性分析关联差异菌群与差异代谢物。
三、研究结果
2.1. Effects of BZF on Growth Performance and Organ Indices（BZF对生长性能与器官指数的影响）
体长、体重及Fulton's条件因子(K)未见显著变化；L-BZF组肝体指数(HSI)呈下降趋势，H-BZF组HSI显著降低；仅H-BZF组肠体指数(ISI)显著降低，提示BZF选择性影响肝、肠生理状态而非整体生长。
2.2. BZF Exposure Disrupted Intestinal Structure and Barrier Integrity（BZF暴露破坏肠道结构与屏障完整性）
组织学显示BZF致肠上皮绒毛损伤、炎性浸润及H-BZF组肠壁变薄；杯状细胞密度呈剂量依赖性减少。肠道SOD与CAT活性剂量依赖性升高，GSH与MDA无显著变化。表明BZF损伤肠上皮结构，杯状细胞减少削弱黏液屏障，伴随抗氧化防御激活。
2.3. BZF Exposure Altered Gut Microbiota Composition（BZF暴露改变肠道菌群组成）
α多样性分析显示H-BZF组Chao1降低，两处理组Shannon降低、Simpson升高；Bray–Curtis主坐标分析(Principal Coordinates Analysis, PCoA)显示组间群落结构明显分离。门水平上，对照以假单胞菌门(p_Pseudomonadota)为主，H-BZF组放线菌门(p_Actinomycetota)与脱硫杆菌门(p_Thermodesulfobacteriota)富集；属水平上，纤维单胞菌属(g_Cellulomonas)在H-BZF组富集，副球菌属(g_Paracoccus)减少。LEfSe分析确认各组特征菌群，说明BZF诱导肠道微生态失调。
2.4. BZF Exposure Was Associated with Hepatic Alterations in Zebrafish（BZF暴露伴肝脏改变）
肝脏组织学见肝细胞肿胀、炎性浸润及肝索排列紊乱，H-BZF更重。血清ALT、AST、ALP活性及LPS水平均升高。肝脏SOD、CAT显著升高，L-BZF组GSH显著降低，两处理组MDA显著升高（H-BZF尤甚）。提示BZF致肝损伤、氧化应激及氧化还原失衡，并伴循环LPS升高提示肠源性影响。
2.5. BZF Exposure Induced Hepatic Metabolic Disturbance（BZF暴露诱导肝脏代谢扰动）
1H NMR代谢组学主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)与偏最小二乘判别分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis, PLS-DA)显示组别分离。筛选得到39个差异代谢物（VIP>1，FDR<0.05）：L-BZF组27个，涉及氨基酸、胆碱类、碳水化合物、谷胱甘肽相关及能量代谢中间体；H-BZF组30个，涉及氨基酸、脂质、短链脂肪酸与酮体相关及乙酰化化合物。KEGG富集显示甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢及甘油磷脂代谢在两剂量组均显著扰动；丁酸代谢(Butanoate metabolism)在H-BZF组特异富集；精氨酸-脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢及精氨酸生物合成在L-BZF组较突出，证实肝脏多条代谢通路受扰。
2.6. BZF Exposure Altered Gene Expression in Liver and Intestine（BZF暴露改变肝、肠基因表达）
肝脏中tlr4ba、traf6、lbp在两剂量组均上调，nfκb与tnf-α仅在H-BZF组显著上调，myd88呈低剂量下调、高剂量上调的双相模式。肠道中muc2.1与claudin 1两剂量组均显著下调，muc5.1与zo-1仅H-BZF组显著下调。表明BZF激活肝脏炎症相关信号，并损害肠道紧密连接与黏液屏障基因表达。
2.7. Correlation Between Gut Microbiota and Hepatic Metabolic Profiles（肠道菌群与肝脏代谢谱的相关性）
门水平p_Verrucomicrobiota、p_Pseudomonadota、p_Actinomycetota分别与25、21、21个差异代谢物显著相关；属水平g_Paracoccus（与26个差异代谢物相关）、g_Haloferula、g_Paludisphaera等与多类肝脏代谢物显著相关。层次聚类将代谢物分为两类具有相反相关模式的簇，证实菌群失调与肝脏代谢重编程密切相关。
四、讨论与结论总结
讨论指出，BZF致肠上皮结构损伤、杯状细胞减少及屏障基因(muc2.1、muc5.1、claudin 1、zo-1)下调，削弱黏膜防御；菌群α多样性下降、p_Pseudomonadota减少而p_Actinomycetota与p_Thermodesulfobacteriota富集提示促炎微环境偏移，且与肝脏代谢物显著关联，支持肠-肝轴介导肝毒性。肝脏HSI降低伴病理损伤、转氨酶升高、氧化指标(SOD、CAT升高，GSH降低，MDA升高)及炎症基因(tlr4ba、lbp、traf6等)上调，说明BZF经肠源性LPS易位与局部氧化应激共同致肝损伤——需注意斑马鱼Tlr4可能不具典型哺乳动物LPS受体功能，上述基因为炎症相关改变而非经典LPS–TLR4通路直接证据。代谢组学证实氨基酸、甘油磷脂及丁酸代谢等通路紊乱，与菌群SCFA代谢改变呼应。研究类比同类SDHI杀菌剂腐霉利(boscalid)报道，强调肠-肝轴为环境污染物毒性靶标。
结论（翻译）：
综上所述，BZF暴露诱导斑马鱼肠道微生物群失调、肠道结构损伤及肠道屏障完整性受损。上述改变伴随血清LPS水平升高及肝脏炎症相关基因表达改变，提示肠-肝轴相关响应与BZF暴露后肝脏改变存在关联。肝脏代谢组学进一步显示氨基酸与脂质代谢紊乱，表明代谢稳态被破坏。值得注意的是，上述效应在50 μg/L H-BZF组更为显著。这些发现表明肠-肝轴相关改变与BZF暴露相关联。尽管本研究为SDHI类杀菌剂潜在毒理效应提供了新见解，仍需进一步验证该关联并阐明潜在机制，包括肠道屏障完整性的功能验证及肠源性炎症信号在肝脏响应中的作用。
