甲基咪唑鎓离子液体 M8OI 对大鼠的神经行为效应

《Journal of Xenobiotics》：Neurobehavioural Effects of the Methylimidazolium Ionic Liquid M8OI in Rats

　　

M8OI 是一种具有细胞毒性的甲基咪唑鎓离子液体（ionic liquid）溶剂，其毒性机制在于与线粒体电子传递链（mitochondrial electron transport chain）复合体Ⅰ（complex I）上的泛醌结合位点结合。鉴于其毒作用机制与农药鱼藤酮（rotenone）存在重叠，研究人员考察了 M8OI 的潜在神经毒性效应。在体外实验中，研究人员在 SH-SY5Y 细胞中通过测定 MTT 还原以及采用 Seahorse 分析仪检测氧耗率和细胞外酸化率，评估细胞毒性和线粒体功能。通过以半乳糖替代培养基中的葡萄糖，SH-SY5Y 细胞对 M8OI 毒性的敏感性增强。葡萄糖可保护细胞免受 M8OI 毒性影响，而半乳糖未显示明确的剂量-反应性保护作用。M8OI 诱导氧耗率呈剂量依赖性下降，并伴随细胞外酸化率代偿性升高，这与线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）受抑及代谢向糖酵解（glycolysis）转移一致。在体内实验中，大鼠经饮水口服暴露 20 周，并接受行为学测试评估。此外，研究人员采用液相色谱-质谱联用（LC–MS）测定大鼠脑及其他组织中 M8OI 及其代谢物的浓度。在大鼠体内，肾脏中的 M8OI 浓度约为脑组织的 30 倍，且脑内水平至少比体外影响 SH-SY5Y 细胞活力的浓度低 100 倍。然而，基于开放场试验（open field test）的结果，M8OI 暴露抑制了运动活动，但未出现焦虑样行为。M8OI 在 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞中的细胞毒性与代谢性线粒体功能障碍相关。然而，经口慢性暴露大鼠所观察到的神经行为改变，发生于显著低于可预测导致神经细胞死亡的脑内浓度水平。尽管如此，急性体外暴露与慢性体内结局之间的直接比较仍应谨慎解释。

该研究发表于《Journal of Xenobiotics》，围绕人工合成甲基咪唑鎓离子液体 1-辛基-3-甲基咪唑鎓（M8OI）的潜在神经毒性展开。离子液体因低挥发性和良好溶解性能，被广泛视为“环境友好型”溶剂，并逐渐进入工业分析、药物递送和制药开发等领域。然而，随着这类化合物在环境和人体样本中被检出，其长期安全性问题日益受到关注。既往研究已表明，M8OI 可由胃肠道吸收，在体内发生有限代谢，并可在肾脏、肝脏及心脏相关研究中表现出一定毒性。更重要的是，M8OI 的早期细胞毒性事件是抑制线粒体电子传递链复合体Ⅰ，并与鱼藤酮共享泛醌结合位点这一关键毒理靶点。由于复合体Ⅰ抑制与帕金森病（Parkinson’s disease, PD）相关神经毒性密切相关，研究人员据此提出：M8OI 是否也可能引发神经行为异常，值得系统评估。

当前该领域存在几个关键问题。首先，已有关于离子液体神经毒性的研究多集中于含不同阴离子的咪唑鎓盐，但离子液体由阳离子和阴离子两部分组成，二者可能分别或协同产生毒性，因此单独评估 [C₈mim] 阳离子本身的作用具有必要性。其次，既往体外研究虽然提示 M8OI 可导致活性氧（reactive oxygen species, ROS）增加、线粒体功能受损和细胞凋亡，但其是否能够在整体动物水平上引起明确的神经行为学后果，尚缺乏直接证据。再次，体外毒性浓度与体内实际脑暴露水平之间常存在显著差距，如何理解低脑浓度条件下的功能改变，也是毒理学解释中的难点。因此，本研究试图结合体外机制实验、体内长期口服暴露行为学评价，以及组织中 M8OI 和代谢物定量分析，从而更完整地界定 M8OI 的神经行为危害特征及其与线粒体毒性的关系。

在技术方法方面，研究人员主要采用了三类策略。其一，以人 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞作为体外神经元样模型，通过 MTT 还原实验评估细胞代谢活性/存活能力，并借助 Seahorse XFe96 平台实时检测氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），分析线粒体氧化磷酸化与糖酵解变化，同时利用葡萄糖/半乳糖替换培养条件检验能量底物对毒性的调节作用。其二，在大鼠长期口服暴露模型中，采用开放场试验（OFT）、转棒试验（rotarod）和高架十字迷宫（EPM）评估自主活动、运动协调和平衡能力及焦虑样行为。其三，研究人员利用既往暴露队列的雄性 Wistar 大鼠组织样本，通过液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）定量脑、肾和血清中的 M8OI 及其羟基化、羧基化代谢物，以获得组织分布信息。行为学研究采用雄性和雌性 Albino Wistar 大鼠，组织定量则来自独立的雄性 Wistar 大鼠既有样本队列。

在研究结果方面，论文首先以“Glucose Attenuates M8OI Toxicity in SH-SY5Y Cells, Whereas Galactose Sensitises Cells”为题，说明不同能量底物条件显著影响 M8OI 的细胞毒性。研究显示，SH-SY5Y 细胞暴露 M8OI 24 h 后，MTT 还原能力呈剂量依赖性下降；培养基中葡萄糖浓度越高，细胞对 M8OI 的耐受性越强。相反，当葡萄糖被半乳糖替代后，细胞对 M8OI 明显敏感化，提示在依赖线粒体氧化磷酸化供能的状态下，M8OI 的毒性更易显现。这一结果支持了 M8OI 作用于线粒体能量代谢核心环节的观点，也表明糖酵解代偿可在一定程度上缓冲其毒性。

其次，在“M8OI Suppresses Mitochondrial Respiration with a Compensatory Increase in Glycolysis in SH-SY5Y Cells”部分，研究人员通过 Seahorse 实时生物能学分析发现，M8OI 使 OCR 呈剂量依赖性下降，同时使 ECAR 升高，提示细胞线粒体呼吸受抑后，代谢向糖酵解方向补偿性转移。该现象与复合体Ⅰ受抑、氧化磷酸化功能下降的机制一致，也与前述葡萄糖保护效应相互印证。研究据此认为，M8OI 在 SH-SY5Y 细胞中的毒性与其他哺乳动物细胞模型相似，核心均是线粒体生物能障碍而非单纯非特异性损伤。

第三，在“Tissue Levels of M8OI and Metabolites Following Oral Exposure in Rats”部分，研究人员测定了慢性饮水暴露后雄性大鼠组织中的 M8OI 负荷。结果表明，M8OI 及其代谢物可在脑、肾和血清中检出，但脑内浓度明显低于肾脏和血清，肾脏水平约为脑组织的 30 倍。这提示口服暴露后，M8OI 虽可进入脑组织，但总体脑暴露水平较低。结合其为 p-glycoprotein 和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）转运底物这一背景，论文认为血脑屏障外排机制可能限制了其在脑内蓄积。

第四，在“M8OI Suppresses Locomotor/Exploratory Activity Without Marked Anxiogenic Behaviour”部分，研究人员系统评估了长期口服暴露所致行为学变化。开放场试验显示，无论雄性还是雌性大鼠，M8OI 均显著降低总移动距离和平均速度，提示探索活动和一般运动能力受抑。雄性大鼠静止时间增加，中心区停留时间也增加，但贴边行为未见明确变化，因此并不支持明显焦虑样表型。就竖立行为频率而言，雄性与雌性呈现方向相反的性别差异，雄性下降而雌性上升，提示部分行为终点可能存在性别依赖性。转棒试验进一步表明，M8OI 明显降低雌雄大鼠的跌落潜伏期，说明运动协调与平衡能力均受损。高架十字迷宫方面，在所考察的多个终点中，仅闭臂移动距离出现统计学差异，其余多数与焦虑相关指标未发生明显改变。因此，整体结果支持：M8OI 的主要体内表型是运动/探索行为抑制，而非显著促焦虑效应。

讨论部分重点解释了体外高敏感线粒体毒性与体内低脑浓度行为效应之间的“表观脱节”。论文指出，SH-SY5Y 实验清楚表明 M8OI 可通过抑制复合体Ⅰ破坏线粒体生物能，并在高糖环境下被糖酵解代偿部分抵消。但在大鼠体内，脑组织测得的 M8OI 总浓度至少比体外影响细胞活力的浓度低两个数量级，按此推断并不足以引起明显神经细胞死亡。因此，行为异常未必意味着直接中枢神经系统细胞毒性，也可能反映慢性低水平暴露所致的功能性改变，而非结构性神经元丢失。论文同时强调，开放场和转棒表现下降本身不能单独证明直接脑毒性，因为肾脏、心脏、肌肉等外周系统效应亦可能影响行为表现。加之组织定量与行为学分析来自不同队列，且未进行脑区特异性定量、脑内复合体Ⅰ活性、ATP、ROS、多巴胺水平或神经炎症指标测定，因此不能建立直接的药代-药效（PK/PD）联系。研究人员据此主张，应谨慎看待体外急性暴露与体内慢性暴露的直接对应关系。

论文结论部分可译为：经饮水口服暴露 M8OI 的大鼠，即使全脑测得浓度较低，仍表现出运动活动受抑而无明显焦虑样行为。这些体内结果更符合一种不一定需要明显神经元丢失即可发生的功能性效应，并且可能涉及间接性或全身性因素的参与。此类效应的具体机制目前尚不明确，提示在应对 M8OI 及其他甲基咪唑鎓离子液体不良反应时，可能还存在复合体Ⅰ抑制之外的附加通路。体外 SH-SY5Y 数据为急性暴露条件下线粒体生物能破坏提供了机制合理性支持，但不应被直接用于推断体内神经元损伤。

总体而言，该研究的价值在于，将 M8OI 的已知线粒体毒性机制与整体动物神经行为学表型联系起来，提示甲基咪唑鎓离子液体即使在脑内累积较低，也可能造成可检测的功能改变。论文并未夸大其直接神经毒性，而是较为谨慎地指出，这种行为学改变可能由中枢与外周多因素共同驱动。对于离子液体作为环境暴露物和潜在药用辅料的安全性评估而言，这项研究提供了重要依据：不能仅依据组织浓度高低或细胞致死阈值判断风险，还需关注长期低水平暴露下的功能终点及系统性毒理后果。