非洲猪瘟病毒基因型Ⅰ、基因型Ⅱ及基因型Ⅰ/Ⅱ重组体双重重链式反应定量检测方法的建立

《Viruses》：Establishment of a Duplex Quantitative PCR Assay for the Detection and Differentiation of African Swine Fever Virus Genotype I, Genotype II, and Genotype I/II Recombinants

　　

非洲猪瘟（African Swine Fever, ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)引起的高致死性发热性传染病，主要感染家猪和野猪。近期，在中国、越南和俄罗斯出现了具有高毒力的重组型ASFV，其嵌合基因组来源于p72基因型Ⅰ和Ⅱ型病毒。这些基因型Ⅰ/Ⅱ重组体能够逃逸由基因型Ⅱ型病毒诱导的免疫保护，包括疫苗源性免疫，从而使疾病防控更加复杂化。为应对这一挑战，研究人员开发了一种新型双重量化PCR（duplex quantitative PCR, qPCR）检测方法，可在单一反应中同时检测并鉴别基因型Ⅰ、Ⅱ及Ⅰ/Ⅱ重组体。该方法表现出高灵敏度和高特异性，对基因型Ⅰ和Ⅱ型ASFV DNA的可靠检测限均为10拷贝/反应。利用2025年越南北部收集的临床样本进行验证，证实了该方法在准确鉴别流行基因型Ⅱ型病毒与重组型Ⅰ/Ⅱ型病毒方面的稳健性能，包括潜在混合感染的检测。对选定阳性样本的全基因组测序进一步证实了上述发现。总体而言，该qPCR检测方法为识别当前流行的ASFV基因型提供了精确且高效的工具，从而有助于改善疾病监测并促进对ASFV遗传多样性日益增加地区流行病学演变的全面理解。

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、高度致死性出血性疾病，被世界动物卫生组织列为须通报动物疫病。自2007年高毒力基因型Ⅱ型ASFV传入高加索地区后，该病毒在欧洲和亚洲持续扩散。2018年，基因型Ⅱ型ASFV在中国首次被发现，随后迅速蔓延至亚洲多数国家。更为严峻的是，近年来在中国、越南和俄罗斯等地出现了源自基因型Ⅰ和Ⅱ型病毒的高度毒力重组型ASFV(基因型Ⅰ/Ⅱ重组体)。这些重组病毒能够逃逸基于基因型Ⅱ型病毒所诱导的免疫保护，包括现行疫苗的保护作用，从而可能在基因型Ⅱ型病毒已流行的地区持续传播和扩散。因此，准确鉴定流行ASFV毒株对于流行病学评估和制定有效防控策略至关重要。

尽管已有多种可鉴别基因型Ⅰ、Ⅱ及Ⅰ/Ⅱ重组体的qPCR检测方法被开发出来，但这些方法所靶向的基因区域可能在非目标基因型中发生自然缺失，提示这些基因对ASFV而言可能并非必需，类似的缺失在未来也可能出现。为此，研究人员将注意力转向CP2475L基因，该基因编码结构性前体蛋白pp220，是核心衣壳组装所必需的关键蛋白，且位于ASFV基因组中基因型依赖性保守的中心区域。基于这一特性，研究人员开发了一种靶向CP2475L的新型双工qPCR检测方法，旨在实现对基因型Ⅰ、Ⅱ及Ⅰ/Ⅱ重组体的精准鉴别，并通过野外采集样本对其性能进行了全面评估。

该研究采用了以下几项关键技术方法：标准质粒构建与标准曲线制备；双工qPCR反应体系的优化，包括引物和探针浓度及退火温度的系统筛选；分析灵敏度、特异性及重复性评价；合成重组对照模板的制备与Ct值差异分析；2025年越南北部ASF疫情猪场采集的20份临床样本的检测；以及阳性样本的全基因组测序与系统发育分析。

研究结果部分首先涉及分析灵敏度、特异性及重复性评价。研究人员使用10倍系列稀释的混合标准质粒(10⁰至10⁶拷贝/反应)评估双工qPCR的分析灵敏度。标准扩增曲线显示，基因型Ⅰ的斜率为-3.329，相关系数(R²)为0.999，扩增效率为99.7%；基因型Ⅱ的斜率为-3.377，R²为0.993，扩增效率为97.8%。两个基因型在低至10拷贝/反应的浓度下均可获得可靠扩增，据此将基因型Ⅰ的检测阈值设定为Ct≤37，基因型Ⅱ为Ct≤39。特异性评价中，基因型Ⅰ代表株E75仅显示基因型Ⅰ靶标扩增，基因型Ⅱ代表株Armenia07仅显示基因型Ⅱ靶标扩增，人工混合样本则显示双重扩增，而基因型Ⅹ代表株Kenya05/Tk-1无扩增信号。重复性评价显示，批内变异系数(Coefficient of Variation, CV)为0.37%-0.99%，批间CV为0.28%-1.21%，表明该方法具有良好的重复性。

在合成重组对照的扩增效率评价中，研究人员制备了包含两个基因型特异性靶标区域的合成CP2475L片段作为重组对照。结果显示，当两个靶标区域位于同一模板分子上时，基因型Ⅰ和Ⅱ特异性靶标的Ct值相近，ΔCt[Ct_genotypeⅡ?Ct_genotypeⅠ]为0.74±0.66(均值±3标准差)。基于该参考范围，ΔCt值超出0.08至1.40范围的样本被判定为两种不同ASFV毒株的混合感染。

临床样本基因分型结果显示，20份野外样本中17份为ASFV阳性。其中15份同时显示基因型Ⅰ和Ⅱ特异性靶标的扩增，提示存在重组型ASFV。在这15份样本中，2份样本(VN/TH/62/2025和VN/TH/03/2025)的ΔCt值分别为-5.2和-6.9，明显超出合成重组对照的参考范围，因此被解释为两种不同ASFV毒株的混合感染。其余2份样本判定为基因型Ⅱ阳性。

全基因组测序分析中，15份重组型阳性样本中有10份成功获得覆盖全基因组的重叠PCR扩增子，进行了全基因组分析。系统发育分析显示，这10个重组型ASFV均与近期报道的基因型Ⅰ/Ⅱ重组株聚类，与2023年越南北部分离的参考重组株VNUA/rASFV/PT2/2023(GenBank登录号PP810980)的核苷酸序列一致性高达99.93%-99.99%。此外，VN/PT/20/2025、VN/PT/21/2025和VN/LS/08/2025在MGF505-7R和MGF505-8R基因区域存在相似缺失，而VN/LS/08/2025还在KP86R、KP93L、MGF360-1L和MGF360-2L等多个基因存在额外缺失。

讨论部分指出，目前ASF疫苗主要为基因型Ⅱ型来源的活减毒疫苗，虽对同源毒株具有有效保护作用，但对异源或基因型不同的病毒，包括近期流行的基因型Ⅰ/Ⅱ重组株，仅能提供有限保护。在越南，尽管已实施国家动物卫生机构批准的疫苗接种计划，重组型病毒的流行似乎仍在增加，当前的疫苗接种策略可能不足以应对，甚至可能促进进一步的病毒重组。因此，能够快速检测重组病毒入侵的可靠诊断方法对于加强防范和有效应对新兴威胁至关重要。

该研究开发的双工qPCR检测方法在分析性能上与既往报道的基因型鉴别qPCR方法相当或更优。既往方法的检测限范围约为1.18至62,600拷贝/反应，而本研究方法的检测限达到10拷贝/反应，且具有近完美的扩增效率和良好的线性关系，同时保持精确的基因型鉴别能力。该方法的高重复性(CV 0.20%-1.21%)进一步支持其作为稳健、灵敏的基因型特异性ASFV检测平台。

2025年越南北部临床样本的验证结果证实了该方法检测基因型Ⅰ/Ⅱ重组型ASFV的实际应用价值。全基因组测序显示，尽管流行重组病毒相对于中国和越南既往报道的参考基因组存在全基因组水平的单核苷酸替换累积，但CP2475L靶标区域在所有分析样本中均保持保守。这种保守性支持了引物和探针设计的稳健性，增强了该方法检测当前流行重组变种的可靠性。

该双工qPCR方法还可用于识别混合感染样本。在同时显示两个基因型特异性靶标扩增的临床样本中，部分样本的ΔCt值明显超出合成重组对照的参考范围，提示可能为重组型ASFV与基因型Ⅱ型ASFV的混合感染。然而，在地方流行背景下，ΔCt值在参考范围内的样本仍可能包含基因型Ⅰ和Ⅱ型ASFV水平相当的情况，或重组病毒与低水平基因型Ⅰ或Ⅱ型病毒的混合感染，因此不能仅根据ΔCt值在参考范围内即排除混合感染的可能。

研究发现具有不同基因缺失的重组病毒的存在，表明越南北部的ASFV感染正变得越来越多样化和复杂化。多种病毒株(包括疫苗株)的共同流行使分子监测复杂化，降低了检测准确性和流行病学解读的可靠性。在此背景下，该双工qPCR检测方法成为及时识别新兴变异株和改善监测策略的宝贵工具。

研究结论指出，研究人员成功开发了一种高灵敏度、高特异性的双工qPCR检测方法，能够快速鉴别基因型Ⅰ、Ⅱ及Ⅰ/Ⅱ重组体。该方法在野外样本中表现出稳健性能，适用于检测当前流行的重组病毒。这一诊断工具将增强分子监测能力，支持ASFV遗传多样性日益增加地区的ASF防控工作。该论文发表在《Viruses》。