《Food Structure》：Spectral Confocal Microscopy combined with quantitative image analysis for spatial mapping of insect particle within extruded matrix
编辑推荐：
Gabriel LE FLEM|Manar HARB|Francine FAYOLLE|Vanessa JURY|Laurence DUBREIL奥尼里斯，南特大学，法国国家科学研究院，GEPEA，法国国家科学研究院UMR 6144，法国南特44000摘要近年来，随着植物蛋白、昆
Gabriel LE FLEM|Manar HARB|Francine FAYOLLE|Vanessa JURY|Laurence DUBREIL
奥尼里斯，南特大学，法国国家科学研究院，GEPEA，法国国家科学研究院UMR 6144，法国南特44000
摘要
近年来，随着植物蛋白、昆虫蛋白、替代脂肪以及创新纤维等新原料的引入，食品产品的开发经历了重大变革。这些进步旨在满足消费者对更健康、更可持续且来源合乎道德的产品的需求。然而，将这些新型成分融入产品之中面临着超出产品配方层面的挑战。显微镜技术被广泛用于分析这类新兴食品的微观结构，但由于该技术有特定的要求，样品制备过程可能会引入伪影。在本研究中，共聚焦光谱激光显微镜被用作一种有效的无标记工具，用于分析由昆虫提取物制成的食品。研究人员开发了一套结合光谱自荧光成像与定量图像分析的专用工作流程，以此区分昆虫来源的成分与周围的挤出基质。通过利用不同相体的固有自荧光特性，该方法能够实现昆虫颗粒在含水基质中的空间定位，包括检测昆虫颗粒、测量颗粒面积以及分析其空间分布。这种结合光谱分析与定量分析的方法为研究富含昆虫成分的挤出物的微观结构提供了新视角，同时也为替代蛋白来源的详细结构分析提供了有力工具，有助于新型肉类替代品的研发。
该技术被用作一种有效的非破坏性工具，用于分析由昆虫提取物制成的食品。研究人员通过无标记样品制备、光谱成像设置以及图像处理技术，利用昆虫成分的固有自荧光来探究其在挤出基质中的空间分布。这一方法为替代蛋白来源的详细结构分析提供了重要依据，有助于新型肉类替代品的开发。
引言
随着全球对可持续蛋白质替代品需求的不断增加，人们越来越关注可食用昆虫作为有潜力的替代食品原料。昆虫能提供高质量的蛋白质、必需氨基酸以及生物活性化合物，且与传统家畜相比，其对环境的影响要小得多（Smetana等人，2023年）。不过，消费者接受度仍然是一个关键问题。克服这一障碍的一个有效方法是将昆虫来源的成分融入肉类替代品中（Gallen等人，2019年；Le Goff和Delarue，2017年；Pantin-Sohier等人，2022年）。尤其是通过挤出工艺处理昆虫粉，可以形成类似传统肉类产品在质地和外观上的纤维结构（Azzollini等人，2019年；Kiiru等人，2020年；Kim等人，2024年；Smetana等人，2018年）。
尽管在昆虫基食品的加工方面已取得相当进展，但这些挤出产品的详细结构特征研究仍相对有限，昆虫基挤出物也大多尚未得到充分探索。建立可靠的表征方法对于更好地了解昆虫成分在基质中的空间分布、确保产品一致性、优化配方以及满足监管要求至关重要。
显微镜是研究食品微观结构的强大工具。扫描电子显微镜虽能提供高分辨率图像，但需要经过脱水、金属涂层等样品制备步骤，这些步骤可能会引入伪影，使得无法观察样品在天然含水状态下的情况（McClements等人，2021年）。目前关于昆虫基挤出物的研究仍然较少，大多数结构分析都依赖于扫描电子显微镜（Alam等人，2019年；Azzollini等人，2019年；Kiiru等人，2020年；Smetana等人，2018年）。该技术已被用于观察纤维状结构（Schreuders等人，2021年；Smetana等人，2018年）。然而，仅依靠扫描电子显微镜无法获取有关基质中相体相互作用、脂质分布或蛋白质结构的信息。它的主要局限性在于无法在没有额外标记技术的情况下区分不同的生物聚合物相体，而且它主要关注表面特征而非内部结构。此外，制备过程中水分的去除可能导致原始网络收缩或崩解，从而掩盖蛋白质纤维或脂肪区域的真实排列情况（Dekkers等人，2018年；Schreuders等人，2019年；Kiiru等人，2020年）。
因此，虽然扫描电子显微镜适用于定性表面分析，但为了能够捕捉食品在含水状态下的特征并了解其内部微观结构及相体分布，还需要借助共聚焦激光扫描显微镜或基于X射线的成像技术等互补技术（Dekkers等人，2018年；McClements等人，2021年；Smetana等人，2018年）。共聚焦激光扫描显微镜是一种无需标记即可通过食品成分的固有自荧光实现原位成像的技术，无需额外染色即可揭示结构特征（Bugusu等人，2006年；Castanha等人，2023年；Chou?t等人，2019年；Li等人，2023年；Schreuders等人，2019年；Y. Wang等人，2023年）。
本研究旨在开发并验证一种光谱共聚焦荧光显微镜分析方法，用于研究无标记挤出基质中昆虫来源成分的空间分布。虽然此前已有无标记共聚焦激光扫描显微镜被应用于复杂的食品体系，但本研究的创新之处在于将光谱自荧光识别技术与专门针对昆虫基挤出物设计的自动化空间分析工作流程相结合。该方法将光谱成像与多种定量指标相结合，包括昆虫颗粒检测、颗粒面积测量、基质总面积测定以及基于Vorono?算法的空间分析，从而全面了解昆虫颗粒在挤出基质中的分布与组织情况。了解昆虫来源成分在挤出基质中的空间分布与组织结构，对于理解挤出过程中的各种结构形成机制，如相体分离、基质凝聚等，具有重要意义。这些微观结构特征会直接影响成分的分布、产品质地以及富含昆虫成分的肉类替代品的结构稳定性。
本研究提出了一种结合光谱分析与定量分析的框架，为研究富含昆虫成分的挤出物的微观结构提供了新的描述方法，有助于深入理解昆虫基肉类替代品的组织结构与功能特性。
章节节选
样品制备
豌豆蛋白分离物Nutralys? F85M由Roquette Frères S.A.（法国莱斯特雷姆）提供，而黄粉虫幼虫粉则由Nutriearth（法国）提供。为帮助塑造肉类替代品的质地，还在配方中添加了小麦面筋分离物（来自法国Louis Fran?ois公司），并将其记为WG。此外，配方中还加入了氯化钠和碳酸氢钠（均来自法国Cédo公司）。
共测试了五种不同的混合物：用不同比例的昆虫粉替代豌豆蛋白分离物，替代比例分别为0%、12.25%、25%、37.5%和50%，其余成分保持不变。
结果与讨论
本研究旨在开发一种利用共聚焦光谱成像技术来可视化并量化挤出肉类替代品中昆虫来源成分空间分布的方法。通过利用这些成分的固有自荧光特性，该工作流程能够在无需标记的情况下区分昆虫来源的颗粒与周围的植物蛋白基质。
结论
本研究的主要贡献在于开发出一种结合光谱共聚焦显微镜与定量图像分析的新方法，该方法能够精确绘制无标记基质中的局部结构特征。虽然实验是在固定后的样品上进行的，但我们想指出，如果显微镜能够设置在生产线附近，就无需在对产品进行甲醛固定后再进行显微镜观察。研究采用了4种激光器进行激发。
CRediT作者贡献说明
Gabriel LE FLEM：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，资源获取，研究实施。Vanessa JURY：撰写——审阅与编辑，监督指导，项目管理。Laurence DUBREIL：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，监督指导，资源获取，方法设计，概念构思。Manar HARB：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，结果可视化，研究实施，正式分析。Francine FAYOLLE：撰写——审阅与编辑，监督指导。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了Carnot Qualiment?项目的支持，该项目的资金来自法国国家科研中心（编号为#20 CARN 0026 01），同时也在2021-2026年的州-地区计划（CPER）框架下开展。我们衷心感谢法国农业与粮食主权部以及卢瓦尔河地区委员会提供的财政支持。此外，我们还要感谢Biogenouest——这个由法国西部地区生命科学与环境领域的技术核心设施组成的网络，它得到了卢瓦尔河地区委员会的资助。
