mmu_circ_0012122/mmu-miR-1843-5p/Sertad2轴：狂犬病病毒感染中的一种新型调控通路

《Virulence》：mmu_circ_0012122/mmu-miR-1843-5p/Sertad2 axis: A novel regulatory pathway in Rabies virus infection

　　

狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）可导致严重的中枢神经系统损伤，但其潜在机制尚不清楚。环状RNA（circular RNAs, circRNAs）已在多种细胞和组织中被鉴定，已知其调控真核生物的基因表达。本研究对感染两种RABV毒株（CVS-11和SRV9）的小鼠脑组织中circRNAs的表达模式进行了研究，并与未感染小鼠的脑组织进行了比较。差异表达分析鉴定出1,306个circRNAs，主要来源于编码外显子，功能富集分析提示其与突触和神经系统通路相关。关键的是，研究人员鉴定并验证了一个新型调控轴——mmu_circ_0012122/mmu-miR-1843-5p/Sertad2轴，其中mmu_circ_0012122作为mmu-miR-1843-5p的海绵（sponge），导致Sertad2上调。该轴差异性调控小鼠神经细胞命运：mmu_circ_0012122敲低可减少坏死细胞和非存活期凋亡细胞，而mmu-miR-1843-5p过表达则抑制存活期凋亡和坏死。进一步综合鉴定发现Sertad2是促进神经细胞凋亡和神经炎症反应的关键介导因子。这些发现强调了circRNAs作为RABV感染期间神经元存活关键调控因子的作用，并突显了mmu_circ_0012122驱动网络作为潜在治疗靶点的重要性。

**研究背景与问题**

狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）是一种单股负链RNA病毒，属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），可感染多种温血动物，引起以中枢神经系统损伤为特征的致死性疾病，一旦发病几乎100%致死，目前尚无有效治疗手段。尽管转录组学和蛋白质组学等技术已被广泛应用于RABV感染与致病机制的研究，但环状RNA（circular RNA, circRNA）在宿主-病毒互作网络中的作用仍知之甚少。circRNA是一类通过前体mRNA反向剪接形成的环状分子，具有5'端帽缺失和3'端poly(A)尾缺失的特征，因其环状结构对核酸外切酶降解具有抵抗性而表现出较高的稳定性。自2013年Hansen等提出circRNA可作为微小RNA（microRNA, miRNA）海绵的功能假说以来，circRNA在多种疾病发展中的作用受到广泛关注，但其在RABV感染模型中的功能尚未得到充分阐明。

**研究目的与意义**

为揭示circRNA在RABV感染中的作用机制，研究人员利用RNA测序技术对感染不同毒力RABV毒株的小鼠脑组织进行circRNA表达谱分析，旨在鉴定差异表达circRNAs（differentially expressed circRNAs, DECs），构建竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）调控网络，并验证mmu_circ_0012122/mmu-miR-1843-5p/Sertad2调控轴在RABV感染中的功能。该研究建立了circRNA介导的网络与RABV神经发病机制之间的直接联系，为理解宿主-病毒相互作用提供了新视角，研究成果发表在《Virulence》。

**关键技术方法**

研究采用3日龄SPF级昆明乳鼠，分为CVS-11强毒株感染组、SRV9减毒株感染组和正常对照组，每组9只小鼠。通过颅内接种建立感染模型后，利用mirVana^TM miRNA分离试剂盒提取脑组织总RNA，经rRNA去除和RNase R消化后进行circRNA富集，采用VAHTS Total RNA测序文库制备试剂盒构建文库，在Illumina HiSeq 2500平台进行双端测序。生物信息学分析使用BWA-MEM进行序列比对，CIRI进行circRNA预测，edgeR进行差异表达分析，clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析。通过Targetscan和miRNada预测靶miRNA，利用Cytoscape构建互作网络。实验验证方面：采用PCR联合发散引物和聚合引物验证mmu_circ_0012122环状结构；构建circ12122和circ12122-MS2过表达载体，通过In-Fusion克隆技术转染N2A小鼠神经母细胞瘤细胞；利用MS2-CP-Flag pull-down实验结合高通量测序鉴定吸附的miRNA；采用双荧光素酶报告基因 assay验证circRNA-miRNA及miRNA-mRNA相互作用；运用CCK-8法检测细胞增殖，Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡，RT-qPCR检测炎症因子表达。

**研究成果**

**RABV感染小鼠脑的验证及circRNA表达特征分析**

研究人员通过每日观察确认SRV9感染组小鼠出现颤抖、后肢无力、精神沉郁等症状，CVS-11感染组则表现为毛糙、后肢麻痹、精神状态差，体现出毒力差异。Reed-Muench法测定病毒滴度分别为10⁵ TCID₅₀/mL（SRV9）和10⁴ TCID₅₀/mL（CVS-11）。RNA测序共产生约7.5亿条 reads，每样本约8,000万条，clean reads基因组比对率达99.48%-99.72%。各组circRNA平均数量分别为29,574±3,354（对照组）、30,613±1,792（CVS-11组）和32,224±2,298（SRV9组），表明RABV感染导致小鼠脑组织circRNA丰度增加。90.40%的circRNAs来源于外显子，9.60%来源于内含子区域，10,737个基因产生circRNA，其中74.07%的基因产生1-10个circRNA。

**circRNA差异表达分析**

三组比较共鉴定出1,306个DECs。SRV9 vs 对照组中，454个DECs（287个上调，167个下调）；CVS-11 vs 对照组中，513个DECs（324个上调，189个下调）；SRV9 vs CVS-11组中，571个DECs（330个上调，241个下调）。CVS-11组较SRV9组产生更多DECs，反映强毒株更严重的病理影响；SRV9与CVS-11之间的显著差异则提示circRNAs参与调控病毒致病性和宿主免疫反应。

**circRNA亲本基因的GO和KEGG富集分析**

GO分析显示，SRV9感染组富集于"突触组织"（synapse organization, GO:0050808）、"树突形态发生"（dendrite morphogenesis, GO:0048813）和"轴突发生"（axonogenesis, GO:0007409）等terms；CVS-11感染组则富集于"树突发育"（dendrite development, GO:0016358）和"突触组装调控"（regulation of synapse assembly, GO:0051963）。SRV9与CVS-11直接比较中，"凋亡过程"（apoptotic process, GO:0006915）显著富集。KEGG分析显示，SRV9感染组涉及"吗啡成瘾"（mmu05032）和"嘌呤代谢"（mmu00230）通路，CVS-11感染组涉及"泛素介导的蛋白水解"（mmu04120）和"内吞作用"（mmu04144）通路，两组比较中"ErbB信号通路"（mmu04012）、"轴突导向"（mmu04360）和"MAPK信号通路"（mmu04010）差异富集，这些通路对维持神经元细胞骨架完整性、突触可塑性和生长锥动态至关重要。

**mmu_circ_0012122过表达载体的构建与表征**

从1,306个DECs预测到1,911个靶miRNA，共563,113个可能结合位点。筛选在两种病毒感染组中一致上调的55个候选circRNAs，经显著性、表达丰度、miRNA海绵潜能和新颖性排序，选定mmu_circ_0012122（812 nt）进行深入研究。确认其环状结构后，构建circ12122和circ12122-MS2过表达载体，转染N2A细胞后目标基因表达量分别增加27,167倍和24,069倍，PCR产物测序证实预期连接位点的环化。

**mmu_circ_0012122吸附miRNA的鉴定与筛选**

MS2-CP-Flag pull-down实验显示circ12122-MS2（绿色）与MS2-CP（红色）成功共定位于N2A细胞，Western blot证实MS2-CP-Flag在pull-down产物中富集，RT-qPCR验证mmu_circ_0012122大量捕获。pull-down产物测序鉴定391个miRNAs，其中106个为circ12122-MS2 & MS2-CP组特有。经高丰度测序reads、预测结合亲和力及神经元生物学相关性交集筛选，首先验证的mmu-miR-7020-5p、mmu-miR-6975-5p、mmu-miR-7226-5p在双荧光素酶实验中无显著相互作用，继而验证第二批mmu-miR-139-3p、mmu-miR-1843-5p、mmu-miR-193a-5p。双荧光素酶报告基因 assay显示mmu-miR-1843-5p转染显著降低psi-mmu_circ_0012122-wt-psiCHECK2的相对荧光活性比值（Renilla/Firefly），荧光原位杂交（FISH）证实两者在N2A细胞胞质中共定位。

**mmu_circ_0012122/mmu-miR-1843-5p/Sertad2调控轴的分子验证**

通过multiMiR预测198个mRNA分子，与同期mRNA测序检测到的30,000余个差异表达mRNA取交集，仅获得Sertad2一个交集分子，提示其为mmu-miR-1843-5p的潜在靶点。RT-qPCR显示CVS-11强毒株感染较对照组mmu-miR-1843-5p表达降低、Sertad2表达升高。双荧光素酶报告基因 assay证实mmu-miR-1843-5p与Sertad2-3'UTR存在显著相互作用。功能验证表明：mmu_circ_0012122敲低导致mmu-miR-1843-5p表达增加、Sertad2表达降低；反之，mmu_circ_0012122过表达增加Sertad2水平，而mmu-miR-1843-5p过表达降低Sertad2水平，证实mmu_circ_0012122作为miRNA海绵通过隔离靶miRNA调控基因表达。

**mmu_circ_0012122/mmu-miR-1843-5p/Sertad2在神经细胞凋亡和炎症中的功能分析**

CCK-8实验显示mmu_circ_0012122敲低显著增强48小时细胞活力，mmu-miR-1843-5p过表达初期降低活力但72小时恢复。流式细胞术分析表明，mmu_circ_0012122敲低主要减少Annexin V^?PI⁺坏死细胞（Gate Q1）和Annexin V⁺PI⁺非存活期凋亡细胞（Gate Q2），对Annexin V⁺PI^?存活期凋亡细胞（Gate Q3）影响较小；mmu-miR-1843-5p过表达则减少Gate Q3、Q1和Q2区细胞比例。TUNEL染色显示Sertad2过表达显著增加RABV感染N2A细胞的凋亡，其敲低则增强细胞活力。RT-qPCR分析显示RABV感染显著上调促炎因子TNF-α和IL-6表达，Sertad2过表达进一步促进TNF-α表达但不显著改变IL-6，而Sertad2敲低明显抑制TNF-α和IL-6表达，显著减弱RABV触发的神经炎症反应。

**讨论与结论总结**

研究人员指出，尽管circRNA在人和小鼠大脑中高度保守且神经富集，但其在RABV感染中的作用此前几乎未知。本研究发现强毒CVS-11比减毒SRV9诱导更多DECs，提示circRNA表达谱与病毒致病性相关。这一毒株特异性差异的机制可能源于病毒对宿主RNA加工机器的差异化调控，如RABV感染显著改变hnRNP L等RNA结合蛋白的表达，从而影响circRNA生物合成。与其他嗜神经病毒研究相呼应，Zika病毒中hsa_circ_0007321通过miR-492/NFKBID轴抑制病毒复制的机制与本研究发现的mmu_circ_0012122介导轴相似，SARS-CoV-2感染也与中枢神经系统的circRNA谱改变相关，这些汇聚性发现强调了circRNA相关ceRNA网络在病毒-神经元互作中的基础作用。

体内验证显示CVS-11感染导致mmu-miR-1843-5p显著下调伴Sertad2上调，符合ceRNA机制；而SRV9感染中Sertad2表达低于对照组，尽管mmu-miR-1843-5p同样下调，提示减毒株可能招募额外的株特异性调控机制。该调控轴的母源基因和Sertad2基因在人鼠间高度保守，为跨物种研究提供基础。从转化医学角度，靶向该调控回路如采用反义策略抑制促凋亡circRNA或调节miRNA活性，可能成为一种新型神经保护策略。

**研究结论**

该研究描绘了RABV感染小鼠脑中mmu_circ_0012122/mmu-miR-1843-5p/Sertad2这一新型调控轴。转录组分析显示毒株特异性circRNA失调，强毒CVS-11感染较减毒SRV9诱导更显著的 alterations，提示病毒致病性与宿主circRNA表达模式相关。功能验证确认mmu_circ_0012122作为mmu-miR-1843-5p的海绵，从而解除对Sertad2的抑制。关键的是，该轴差异性调控神经细胞活力：mmu_circ_0012122敲低减少坏死和非存活期凋亡（Annexin V⁺PI⁺），而mmu-miR-1843-5p过表达抑制存活期凋亡（Annexin V⁺PI^?）和坏死。综合鉴定进一步发现Sertad2是促进神经细胞凋亡和神经炎症反应的关键介导因子。这些发现强调了circRNAs作为RABV感染期间神经元命运关键仲裁者的作用，并突显了mmu_circ_0012122驱动网络作为潜在治疗靶点的重要性。未来研究应在人神经元模型中探索该轴并评估其在嗜神经病毒中的保守性。