利用代谢糖工程与光交联技术鉴定抑制素（PHB）为高致病性冠状病毒的入侵因子

《Emerging Microbes & Infections》：Identification of Prohibitin (PHB) as an Entry Factor of Highly Pathogenic Coronaviruses Using Metabolic Glycoengineering and Photo-Crosslinking Techniques

　　

冠状病毒（CoV）依赖宿主表面因子介导病毒附着与入侵，然而不同冠状病毒共有的保守宿主辅助因子仍知之甚少。本研究中，研究人员建立了基于代谢糖工程与光交联的宿主因子捕获平台，以在近生理条件下鉴定与冠状病毒刺突（Spike）蛋白相关的宿主因子。利用该方法，研究人员鉴定出抑制素（PHB）为严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）共有的候选Spike相关宿主因子。功能分析显示，膜相关PHB的敲低可降低假病毒感染，而PHB重构或过表达则可增强多种细胞系统的易感性，包括Huh7、BEAS-2B、Calu-3及原代人呼吸道上皮细胞（hAECs）。此外，基于抗体的细胞表面PHB阻断可在hAECs和人肺类器官中抑制假病毒入侵。免疫组织化学分析进一步证明PHB在正常人体肺组织中的表达。机制上，重组PHB可与三种冠状病毒的Spike蛋白发生相互作用，该关联得到表面等离子体共振和共免疫沉淀实验的支持。结构预测结合基于片段的丙氨酸扫描鉴定出PHB胞外域139–154位残基为促进Spike高效结合的关键区域。此外，PHB相关假病毒入侵对脂筏破坏敏感，支持胆固醇依赖性膜微域在该过程中的作用。综上，本研究将膜相关PHB鉴定为一种与冠状病毒入侵相关的保守Spike相关宿主因子。

冠状病毒（CoV）作为一类具有包膜的单股正链RNA病毒，其表面突出的刺突（Spike）糖蛋白是介导病毒与宿主细胞识别、结合及膜融合的关键分子。尽管血管紧张素转换酶2（ACE2）等经典受体已被明确鉴定为SARS-CoV和SARS-CoV-2的主要受体，二肽基肽酶4（DPP4）为MERS-CoV的受体，但越来越多的证据表明，冠状病毒的入侵过程涉及更为广泛的宿主辅助因子网络，而非仅限于经典受体的识别。包括跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）、硫酸乙酰肝素、神经纤毛蛋白-1（NRP1）、分化簇147（CD147）、B族I型清道夫受体（SR-B1）、代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）、去唾液酸糖蛋白受体1（ASGR1）以及酪氨酸蛋白激酶受体UFO（AXL）在内的多种分子已被报道参与促进病毒的附着、膜融合或提高入侵效率。然而，这些辅助因子中是否存在能够普遍促进不同冠状病毒入侵的保守膜相关宿主因子，目前尚未完全阐明。这一科学问题的解答对于理解冠状病毒的跨种传播机制、开发广谱抗病毒策略具有重要意义。

为系统鉴定冠状病毒入侵相关的宿主因子，研究人员整合代谢糖工程、光交联技术和蛋白质组学分析，建立了一个创新的宿主因子捕获平台。该平台的核心设计基于冠状病毒Spike蛋白高度糖基化的特性：利用四乙酰基-N-叠氮乙酰甘露糖胺（Ac₄ManNAz）作为代谢前体，通过宿主细胞的内源性糖基化途径将其整合至Spike蛋白的糖链中；随后通过生物正交化学反应将含有双苯并环辛炔（DIBO）基团、双吖丙啶光交联基团和生物素标签的多功能探针共价连接至Spike蛋白；在病毒与宿主细胞附着的近生理条件下，紫外光照射诱导双吖丙啶产生活性卡宾中间体，与邻近的膜蛋白发生共价交联，从而实现对Spike蛋白邻近宿主因子的特异性捕获与富集，最终通过质谱鉴定候选宿主因子。这一策略的优势在于其对Spike蛋白天然构象的最小扰动，以及能够在近乎原生条件下捕获瞬态的病毒-宿主相互作用。

研究人员利用上述平台，以感染三种高致病性冠状病毒假病毒的Huh7细胞为模型，通过定量蛋白质组学分析筛选出26个候选Spike相关宿主蛋白。在优先验证的7个膜相关候选因子中，PHB表现出最为显著且一致的促进三种冠状病毒假病毒入侵的功能：siRNA介导的PHB敲低可显著降低SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2假病毒的感染效率。为进一步验证PHB的功能相关性，研究人员在Huh7、BEAS-2B和Calu-3等多种呼吸道上皮细胞系中建立了PHB基因敲除、敲低和拯救表达体系，结果一致表明膜相关PHB的缺失显著削弱假病毒入侵能力，而PHB重构或过表达则恢复或增强细胞易感性。在更具生理相关性的原代人呼吸道上皮细胞和人肺类器官中，PHB同样呈现促进冠状病毒入侵的作用，且基于抗体的PHB阻断可在纳摩尔浓度范围内有效抑制假病毒附着，而不引起明显细胞毒性。

机制层面，表面等离子体共振分析表明重组PHB可与SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV的Spike蛋白直接结合，平衡解离常数（K_D）分别为203 nM、194 nM和860 nM；共免疫沉淀实验进一步证实了PHB与三种冠状病毒Spike蛋白在细胞内的关联。通过AlphaFold 3结构预测与基于片段的丙氨酸扫描突变分析，研究人员鉴定出PHB胞外域139–154位氨基酸残基为介导Spike蛋白结合的关键功能区段：该区域的突变显著削弱PHB与三种冠状病毒Spike蛋白的相互作用，而对PHB的膜定位影响甚微。

此外，研究人员发现PHB相关冠状病毒入侵对脂筏完整性具有依赖性。甲基-β-环糊精（MβCD）介导的胆固醇耗竭可显著降低Spike蛋白膜结合及假病毒感染效率，而胆固醇回补可部分恢复该表型。免疫荧光分析显示PHB与脂筏标志物Flotillin-1存在空间邻近性，提示PHB可能通过脂筏相关膜微域参与调控冠状病毒的附着或入侵过程，且与经典受体ACE2和DPP4处于相关的膜微环境中。

该研究的技术方法主要包括：（1）基于Ac₄ManNAz代谢糖工程和DIBO-双吖丙啶-生物素多功能探针的光交联平台构建；（2）HIV-1慢病毒骨架的冠状病毒假病毒包装与中性验证；（3）UV诱导光交联结合链霉亲和素亲和富集和标签自由液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学分析；（4）CRISPR/Cas9基因编辑和siRNA介导的PHB敲除/敲低及拯救表达；（5）原代人呼吸道上皮细胞（Procell Biotechnology，货号CP-H209）和人肺类器官（D1Med Medical Technology）的培养与功能验证；（6）表面等离子体共振（SPR）动力学分析和共免疫沉淀实验；（7）AlphaFold 3多聚体结构预测与基于片段的丙氨酸扫描；（8）MβCD介导的脂筏破坏与胆固醇回补实验。

研究结果部分，"代谢标记冠状病毒假病毒的构建与表征"显示，研究人员成功构建了携带SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2 Spike蛋白的HIV-1假病毒系统，经中和抗体验证具有功能性Spike蛋白和低纳摩尔级半最大抑制浓度（IC₅₀）；Ac₄ManNAz代谢标记可实现Spike糖蛋白的高效选择性标记，且不影响假病毒感染活性；Huh7细胞被筛选为支持三种假病毒高效感染的目标细胞系。

"冠状病毒宿主因子捕获光交联平台的开发"部分表明，多功能光交联探针可高效共价连接至代谢标记的假病毒，探针修饰不影响病毒入侵活性；UV照射可选择性形成Spike相关高分子量交联复合物，该平台成功捕获了已知的Spike-ACE2相互作用，证明了方法学的特异性。

"PHB作为冠状病毒Spike相关宿主因子的交联辅助蛋白质组学鉴定"显示，三种冠状病毒假病毒捕获实验共鉴定出209个一致富集蛋白，排除 bald 病毒背景后保留26个候选因子，其中包括此前报道的整合素等入侵相关分子；PHB因高丰度和膜定位特性被优先选择进行功能验证。

"PHB促进冠状病毒Spike介导的假病毒入侵"结果表明，PHB敲低对三种冠状病毒假病毒入侵抑制效果最为显著；PHB敲除显著降低感染效率而重构拯救恢复易感性；anti-PHB抗体呈剂量依赖性抑制入侵；重组PHB与三种Spike蛋白存在直接物理相互作用。

"PHB促进多种上皮细胞系统中的冠状病毒Spike介导假病毒入侵"证实，在BEAS-2B和Calu-3细胞中PHB同样呈剂量依赖性促进三种冠状病毒入侵，表型与Huh7一致。

"PHB相关冠状病毒入侵在原代人呼吸道上皮细胞和肺类器官中的验证"表明，公共转录组数据显示PHB在包括呼吸道在内的多种组织中广泛表达；免疫组织化学证实8例独立供体正常肺组织中PHB的表达及膜定位；hAECs中PHB敲低降低感染、过表达增强易感性；人肺类器官中anti-PHB抗体阻断显著减少假病毒结合，量化流式细胞术确认荧光强度降低。

"PHB胞外域中心区域是冠状病毒Spike结合所必需的"部分，AlphaFold 3预测三种冠状病毒Spike蛋白受体结合域（RBD）均定位于PHB胞外域中心区域；丙氨酸扫描突变分析鉴定139–154位残基为关键结合区段，该区域突变显著削弱Spike结合。

"PHB相关冠状病毒入侵与胆固醇依赖性膜微域相关"显示，MβCD破坏脂筏后Spike膜结合和病毒感染均显著降低，胆固醇回补部分恢复；PHB与脂筏标志物Flotillin-1存在空间共定位，与ACE2和DPP4的膜微环境定位模式相似。

讨论部分，研究人员综合上述发现，将PHB定位为一种保守的膜近端辅助入侵因子，其功能机制不同于经典的病毒受体或已报道的附着因子。PHB可能通过在脂筏相关膜微域中参与形成或稳定Spike-ACE2/DPP4入侵平台，从而促进冠状病毒的高效入侵。尽管该研究主要基于假病毒系统，但原代细胞和类器官模型的验证显著增强了其生理相关性。研究人员同时指出，由于PHB的广泛表达和多效性细胞功能，直接靶向PHB可能存在治疗窗口的限制；未来策略或可聚焦于其胞外Spike相互作用界面的选择性阻断。研究局限性包括缺乏活病毒和体内感染模型验证、PHB-Spike精确分子界面分辨率不足，以及PHB与经典受体及脂筏微域的功能互作机制尚待深入阐明。综上，该研究通过化学驱动的宿主因子分析策略，拓展了对冠状病毒入侵分子机制的认识，为开发广谱抗冠状病毒干预手段提供了新的潜在靶点。该论文发表在《Emerging Microbes》。