综述：纳米孔测序技术在法庭科学中的应用现状及发展趋势

《Annals of Human Biology》：Nanopore sequencing technology in forensic science: status quo and tendency

　　

背景：第二代测序（NGS）凭借高通量优势已在法庭科学中广泛应用，但受限于短读长与非批量检测成本高昂的技术瓶颈。以牛津纳米孔技术（ONT）为代表的第三代测序（TGS）凭借超长读长、便携性、实时测序及无需扩增的检测特性，可有效突破NGS在法医领域的应用限制。 目的：本研究系统梳理纳米孔测序在法医遗传学领域的应用现状，挖掘其潜在应用场景，明确技术优势与优化方向，探讨实际应用面临的挑战，为其大规模法庭科学应用提供全面参考。 方法：研究人员检索PubMed、Web of Science及Scopus数据库中截至2026年2月的英文文献，检索词包含“nanopore sequencing + forensic”等；同时系统梳理相关文献中的技术原理、性能表现、应用场景与挑战等内容，开展文献计量学分析。 结果：纳米孔测序在法庭科学中具有独特优势：超长读长支持单倍型分析、可直接检测甲基化/RNA修饰、设备便携性强。文献计量分析显示该领域研究呈阶段性发展特征，荷兰处于领先地位，欧洲为核心协作区域，研究热点逐步转向前沿应用场景。技术优化已显著提升测序准确性，但低起始量样本处理、标准化缺失等瓶颈仍待突破。 结论：纳米孔测序可作为传统法医测序技术的有效补充，应用前景广阔。随着硬件与生物信息学工具优化、多实验室验证推进及统一标准建立，该技术有望在3–5年内广泛应用于常规法庭科学工作，为司法公正提供技术支撑。

1. 1.
   引言
   第二代测序（NGS）基于Illumina与赛默飞世尔Ion Torrent平台，凭借高通量与多态性同步检测能力已在法庭科学中广泛应用，但其短读长缺陷及非大批量样本/标记检测的高成本，严重限制了其在降解检材、混合检材、微量检材分析及犯罪现场、灾害现场快速检测中的应用。第三代测序（TGS）已成为生命科学领域的研究热点，主流技术包括PacBio SMRT与牛津纳米孔技术（ONT）纳米孔测序：二者均实现单分子测序与超长读长，突破了NGS的技术瓶颈，已应用于生物学研究、临床医学与法医遗传学领域。PacBio SMRT可实现高保真测序（HiFi读长准确率>99.9%），平均读长10–20 kb，适用于高精度实验室法医基因组测序与单倍型分析，但设备体积大、成本高、依赖专业实验室环境且缺乏实时现场检测能力，限制了其野外应用。相比之下，纳米孔测序兼具便携性、低成本、实时测序与核酸修饰直接检测的独特优势，高度适配现场快速检测、混合样本分析、表观遗传标记识别等法医需求。
   测序准确性是纳米孔技术法医应用的核心要素，与碱基识别算法及后续纠错工具密切相关。ONT主流碱基识别工具包括Guppy、Bonito与Dorado：Guppy支持CPU/GPU加速，超级准确率模式下R10.4.1测序芯片的单条读长准确率>95%；Bonito是基于PyTorch的轻量级碱基识别工具，适配便携式现场测序；Dorado是最新GPU加速碱基识别工具，R10.4.1测序芯片下单条读长准确率>97%，具备实时分析能力，是现场法医检测最具潜力的工具。后续纠错工具（Nanopolish、Medaka、Racon）可进一步提升测序准确性：Nanopolish适用于表观遗传标记检测；Medaka基于神经网络广泛用于短串联重复序列（STR）/单核苷酸多态性（SNP）校正；Racon适用于微量样本的混合校正。测序芯片化学迭代（如R10.4.1）与碱基识别、纠错工具的优化，显著提升了纳米孔测序的准确性与通量，为其法医应用奠定了坚实基础。
   纳米孔测序凭借长读长、特定样本无需扩增、无需特殊预处理即可直接测序表观遗传标记与RNA、高通量、结果实时可视化及按需终止测序的特性，结合便携性优势，已在野外新物种发现、临床病原体检测等领域取得显著成果。相较于这些领域，其在法庭科学中的研究与应用相对滞后，但近年相关研究持续增长。其长读长理论上可重构同一条染色体上的大片段单倍型，减少排列组合可能性，助力混合样本分析；便携设备支持犯罪现场即时检测，简化侦查流程并提升办案效率；还可无需复杂预处理直接检测DNA甲基化与RNA，拓展了法医遗传标记范围并提升检测效率，在法庭科学中具有可观的应用潜力。本文系统梳理纳米孔测序的法医应用现状，基于三大主流数据库开展深入文献计量分析以揭示研究热点与发展趋势，分析其实际意义与现存挑战（技术局限、法医验证合规性、伦理与标准化问题），最终探讨其在法医学中的未来发展前景。
2. 2.
   基于文献综述发现的文献计量分析
   纳米孔测序是单分子测序技术，以长读长、仪器便携、测序速度快、数据实时监控为核心特征，基本原理是通过检测单链核酸穿过纳米孔时产生的特异性电信号变化，结合模式识别算法识别核苷酸序列与修饰类型。其在刑事侦查中的突出优势包括：（1）证据能力提升：无需PCR扩增即可实现单碱基检测，避免扩增偏倚；实时测序可在获得足够数据时立即终止；长读长与高通量提升基因组组装完整性，降低组装错误，相同测序深度下组装精度优于NGS或毛细管电泳，减少混合样本分析的排列组合可能性。（2）现场快速检测：设备紧凑便携，支持及时现场检测。（3）检测效率高：可直接检测甲基化等表观遗传修饰，同时分析多种遗传标记，提升信息产出量。以甲基化检测为例，无需亚硫酸氢盐转化，在准确保留碱基修饰信息的同时，避免了化学转化导致的DNA样本损失与转化效率低下问题，为现场快速法医物证检测奠定了基础。
   当前主流纳米孔测序平台包括英国Oxford Nanopore与中国齐碳科技QNome系列；最新版本（Oxford Nanopore PromethION 48、QNome-3841）在测序准确性与通量上已实现显著提升，进一步支撑其法医应用。为开展全面文献计量分析，研究人员从PubMed、Web of Science与Scopus数据库中检索截至2026年2月8日的法庭科学与测序技术领域核心英文文献，检索词组合包括“nanopore sequencing + forensic”“long-read sequencing + forensic genetics”等，共筛选出73篇相关论文。研究人员从发文数量与年度被引频次、研究国家与核心机构分布、国际合作网络、关键词共现四个维度开展系统文献计量分析。
   这73篇论文（2001–2026年）呈现阶段性发展趋势：开创阶段（2001–2016年）仅发表3篇；初步应用阶段（2017–2020年）稳步增长（每年3–5篇），年均被引34.2次；快速发展阶段（2021–2025年）发文量激增（每年8–20篇，2025年占总量27.4%），因发表时间较近，2025年平均被引降至3.5次；2026年已有6篇初步综述类论文。增长动力来自技术进步与法医应急政策支持。
   研究国家分布方面，荷兰以21篇（28.8%）居首，聚焦混合样本分析（由荷兰法医研究所等机构主导）；德国与中国各9篇（12.3%）紧随其后，德国侧重技术标准制定，中国侧重本土化现场检测开发；美国与英国分别贡献4篇与3篇，在AI纠错方向创新度高。核心研究机构包括国际合作组（30篇）、荷兰法医机构（21篇）、德国与中国法医机构（各9篇），研究力量呈现区域集中特征。
   国际合作网络以欧洲为中心，核心合作配对包括德国–美国（4次合作，聚焦技术创新）、德国–中国（3次，聚焦实用试剂盒开发）、荷兰–美国（3次，聚焦质量控制标准）。合作以技术驱动为主，受地理因素影响（欧洲内部合作密集），发展中国家参与度不足，形成“欧洲中心、全球联动”格局。
   关键词共现分析显示核心技术关键词占主导，包括Nanopore（46次）、Sequencing（42次）、Forensic（27次）、Identification（11次）、Analysis（10次）；新兴研究方向包括线粒体DNA（7次）、遗传学（6次）、表观遗传学/甲基化（各2次），表明该领域已进入“基础应用成熟+前沿拓展”阶段。
3. 3.
   纳米孔测序技术在法医遗传学中的潜在应用
   当前法医遗传标记主要包括STR、SNP、RNA与DNA甲基化，用于个体识别、亲权鉴定、系谱推断、地理来源推断与群体信息分析。随着法医侦查中对动物、植物、微生物信息的需求增长，物种鉴定遗传标记检测也成为研究热点。纳米孔测序凭借长读长、直接测序、实时检测的特性，在上述法医遗传标记检测中具有独特优势，并已成功应用于相关检测并取得良好效果。
   3.1 更长测序片段带来更丰富的单片段信息
   更长的核酸片段理论上携带更多遗传信息，但传统检测技术单次仅能检测数百碱基的片段。纳米孔测序实现超长读长检测，可从单片段提取更多信息，这对法医样本检测尤为重要——多数法医样本为降解或混合样本，长读长可显著提升此类样本的检测准确性与信息产出量。
   3.1.1 线粒体DNA检测
   纳米孔测序在法医线粒体DNA（mtDNA）分析与动物物种鉴定中应用潜力显著，可有效解决传统法医检测的关键难题。mtDNA因母系遗传、无基因重组、拷贝数高、样本质量要求低，是母系亲缘鉴定的核心标记，广泛用于变性坏死组织、毛发、骨骼、血痕与陈旧遗骸检测，但传统法医mtDNA分析仅限高变区I、II的部分测序，存在信息不完整与潜在误差问题。
   纳米孔测序有效解决了上述问题：研究人员利用MinION平台实现mtDNA直接测序，数据质量与传统PCR富集法相当；开发了原始数据分析方法，核基因组与线粒体基因组区分准确率超90%；建立了多重全长mtDNA测序方法，可检测频率低于1%的SNP；基于QNome平台开发CmVCall分析方法，在5%异质性水平下，“校正”模型的精确率100%、准确率99.9%、召回率92.3%；还开发了基于QNome的单扩增子长读长人类线粒体基因组测序方法与升级版开源VCall流程，充分验证了纳米孔测序在mtDNA分析中无需扩增、准确性高的优势。
   纳米孔测序在动物物种鉴定中也发挥重要作用。线粒体条形码基因（如COI、12S rRNA、cyt b）因种内保守、种间变异、通用引物可用，是物种鉴定的标准DNA条形码。与不适用于混合样本的Sanger测序不同，纳米孔测序可实现长读长、全长mtDNA测序，且微克级动物DNA无需PCR扩增即可直接检测（减少误差、缩短检测时间）。研究人员验证了基于MinION的纳米孔测序满足法医物种鉴定要求，开发的NGSpeciesID流程生成的共识DNA序列与Sanger对照数据最多仅1个碱基偏差；基于QNome 12S rRNA基因检测开发的ClassIdent开源自动化流程，对60份测试动物样本物种匹配准确率达88.33%，共识序列与Sanger测序结果平均相似度99.34%。此外，纳米孔测序已在食品溯源与肉类来源鉴定中验证良好通用性，进一步拓展了物种鉴定的应用场景。
   3.1.2 单倍型标记
   微单倍型（MH）是指短DNA片段（<300 bp）内包含至少2个SNP的多态性位点，兼具STR与SNP标记的优势，片段短、多态性高、突变率低、无影子峰干扰，适用于混合、低浓度、降解DNA样本及高抑制剂水平样本的法医分析。混合样本分析长期是法医领域的难点，综合MH等位基因计数与测序深度分析，可帮助确定贡献者数量及其单倍型，有效解决复杂DNA混合问题。
   研究人员首次将纳米孔测序平台用于法医复杂DNA混合分析的MH标记检测，证实尽管测序错误率较高，仍可准确识别正确等位基因；利用纳米孔平台成功测序15个MH位点，总准确率达99.83%，验证了纳米孔测序在MH标记检测中的潜力。MiniHap是基于800 bp分子距离内5个及以上SNP的新型法医标记，原理性研究证实QNome设备是MiniHap检测的可行平台；研究人员构建了22-MiniHap系统并完成模拟混合样本分析，成功检测到两人混合比例1:39、三人混合比例1:8:1的样本，进一步验证了纳米孔测序在单倍型检测与混合样本识别中的能力。
   理论上，更长片段可携带更多多态信息，连续测序可降低基因分型组合判定的复杂度。基于纳米孔测序的长读长优势，未来单倍型检测可延伸至更长片段（800–1500 bp），携带更多SNP标记，进一步提升混合样本分析的分辨率，增强混合样本的证据价值。但低模板DNA（LTDNA）法医混合样本的单倍型定相仍是重大技术障碍，核心挑战包括等位基因丢失、高信号噪声、极端混合比例（如1:100）下的低异质性检测限。
   3.2 直接检测：解锁DNA修饰与RNA的潜力
   DNA甲基化与RNA是用于法医年龄推断与体液/组织来源鉴定的重要遗传标记，但传统检测方法需复杂预处理，增加误差风险并限制其法医应用。纳米孔测序可直接测序DNA修饰与RNA，简化检测流程、降低误差风险、提升这些标记的法医实用性。此外，得益于其长读长优势，组蛋白修饰有望成为降解物证分析、同卵双胞胎区分、死亡时间（PMI）推断的新型法医标记。
   3.2.1 DNA甲基化检测
   DNA甲基化广泛用于法医年龄推断与体液来源鉴定，但基于一、二代测序的传统检测方法依赖亚硫酸氢盐转化，会导致DNA广泛片段化并影响检测结果。纳米孔测序凭借长读长优势，可实现DNA甲基化的直接高通量检测，展现出更强的检测潜力。
   研究人员开发了基于纳米孔测序数据的深度学习DNA甲基化检测方法DeepSignal，仅2×测序深度下对5mC与6 mA的检测准确率超90%；验证了纳米孔测序可实现脑肿瘤甲基化分类的稳健快速分析；提出了基于纳米孔的全基因组组蛋白修饰与DNA甲基化定位方法，为法医甲基化检测奠定了实践基础。在法庭科学领域，研究人员利用纳米孔自适应采样实现了年龄相关与体液特异性甲基化标记的同步检测，无需DNA预处理即可分析整个基因区域的多个CpG位点；开展了纳米孔测序的年龄与体液鉴定探索性研究，凸显了PromethION自适应采样在法医年龄预测与体液鉴定中的潜力。
   3.2.2 全长RNA测序
   RNA是体液来源鉴定的核心遗传标记，非编码RNA可用于体液死亡时间（PMI）、伤龄、沉积时间（TSD）推断。当前RNA分析技术需在测序前进行逆转录与PCR扩增，可能导致遗传信息丢失并影响分析结果。纳米孔测序无需PCR扩增即可直接测序RNA并实现结果实时可视化，可有效降低上述风险。
   研究人员利用ONT平台对小鼠脑与肝组织进行RNA测序，检测率优异；开发了基于长读长的全长环状RNA检测方法CIRI-long，可准确检测100–3000 bp范围内的circRNA，是纳米孔RNA测序的重要突破。基于纳米孔测序的法医RNA检测研究仍处于起步阶段：研究人员开发了靶向mRNA纳米孔测序panel，可同时实现体液来源推断与个体识别，为后续法医RNA检测研究提供了宝贵经验，但其具体法医应用仍需进一步研究与验证。
   此外，犯罪现场的微生物生态系统与环境条件密切相关，微生物信息可用于推断PMI、死因、地理来源与个体识别，提供重要侦查线索。16S rRNA测序是微生物检测的核心方法：研究人员利用ONT R10.4.1测序芯片实现全长16S rRNA测序，可精准开展微生物群落物种水平分析，结果与PacBio平台高度一致，展示了纳米孔测序在法医微生物学中的应用潜力，拓展了RNA标记在法庭科学中的应用场景。
   3.3 联合标记同步检测、现场测序：提升案件办理效率
   传统法医生物检材处理需现场采集、包装、实验室运输，流程繁琐耗时，增加样本污染或降解风险。纳米孔测序设备的便携性支持现场检测，缩短现场到“实验室”的距离，有效降低上述风险。此外，不同法医遗传标记可提供不同信息（表型、祖源、系谱），同步检测多种标记或大规模检测单一标记，可显著提升案件侦查效率，满足特定物证分析与侦查需求。
   3.3.1 现场测序
   紧凑便携的纳米孔测序设备可直接部署于现场，减少样本运输距离，降低误差风险，加快案件侦破。这一特性已在野外生物学研究中得到广泛认可：研究人员基于MinION开发了完整的便携式测序实验室系统，并在热带雨林完成现场测试；利用纳米孔测序在热带雨林实现原位物种鉴定，准确率达99%，后续开发出现场检测方案，10小时内即可获得结果，推动了纳米孔测序在野外生物学研究中的广泛应用。
   在法庭科学领域，研究人员将MinION设备与辅助设备集成至便携式检测试剂盒，用于事故现场个体识别，联合检测23个STR并完成49份样本的双盲测试，结果显示基因型检出率95.3%，1150个基因型准确率达86.87%。尽管准确率低于毛细管电泳（CE）与NGS平台，但整体性能充分展示了基于纳米孔的现场测序的未来潜力。纳米孔测序的准确性受测序过程与后续数据分析共同影响，需进一步优化两个阶段以提升现场检测准确性。
   3.3.2 多标记分析
   多标记分析包括多种遗传标记同步检测与单一标记大规模检测。STR与SNP是两大核心法医遗传标记：STR是当前法医工作的首要标记，其在纳米孔平台的检测性能是影响技术法医应用的关键因素；SNP突变率低，可提供表型与系谱信息，是重要补充标记。同步检测STR与SNP可显著提升单次实验的信息产出量。
   研究人员利用纳米孔与Illumina平台同步检测54个STR与94个SNP，SNP检测准确率达99.958%；对包含58个STR与94个SNP的多重扩增体系进行纳米孔测序，所有常染色体STR均实现正确基因分型，SNP总体基因分型准确率达99%；构建了基于ONT的检测系统，整合STR、SNP、插入缺失（InDel）、mtDNA与两类基于甲基化的时钟分类器，准确率优异。这些研究充分验证了纳米孔测序在同步检测多种法医遗传标记（尤其是SNP）方面的潜力。
   法医系谱是重要侦查工具，需要大量遗传标记进行亲缘关系推断。研究人员利用纳米孔测序检测5198个SNP，成功完成第四代亲缘关系分析，展示了纳米孔测序在法医系谱应用中的巨大潜力。
4. 4.
   纳米孔测序未来法医应用的挑战
   法医遗传标记检测的准确性主要受检测过程与数据分析两个阶段影响：测序过程相关因素包括序列结构、测序深度、遗传标记类型，数据读取与分析也会显著影响结果。因此，优化数据处理模型以满足实际检测需求，是纳米孔测序法医应用的核心。近年算法优化已显著提升纳米孔测序准确性，随着算法持续迭代，其通量与准确性不断提升，在临床与法医学中的应用持续拓展。
   纳米孔测序在常规法医工作中的广泛应用，不仅取决于遗传标记检测能力与实验室应用潜力，还与操作人员的数据分析技能密切相关。由于纳米孔测序的准确性部分依赖于操作人员对算法的选择与调优，对操作人员的数据分析能力提出了更高要求，这是当前其法医应用的主要障碍之一，但人工智能技术的发展有望在未来解决这一问题。此外，尽管纳米孔测序支持无需扩增的直接测序，但需要较高的初始核酸投入量（核DNA需微克级），这对多数核DNA产量仅为纳克/皮克级的法医样本而言是巨大挑战。除上述技术局限外，纳米孔测序的法医应用还面临低起始量样本处理瓶颈、法医验证指南合规、伦理与标准化等关键挑战。
   4.1 低起始量样本处理：全基因组扩增策略与无扩增方案
   微克级核DNA需求是纳米孔测序在法庭科学中的核心技术壁垒，多数法医样本（血痕、毛发、接触DNA）仅能获得纳克/皮克级DNA。当前研究聚焦于两类解决方案：全基因组扩增（WGA）与无扩增低起始量文库构建，两类策略基于法医实际场景具有明确的样本类型适配性。
   无扩增工作流程适用于高质量、足量法医样本（如新鲜血液、未降解组织样本），核DNA含量≥1 μg，可避免可能影响测序结果证据价值的扩增偏倚与污染风险。适配纳米孔测序的主流WGA技术包括多重置换扩增（MDA）、多次退火环状循环扩增（MALBAC）与REPLI-g：MDA应用最广，但在重复序列（如STR）中存在扩增偏倚；MALBAC偏倚更低但产量低；REPLI-g兼顾高产与低偏倚。低起始量/微量法医样本（如接触DNA、单根发干、降解骨遗存）核DNA含量≤100 ng，需采用WGA策略，提升模板数量以满足纳米孔测序的最低投入要求；无扩增低起始量文库构建则通过提升DNA模板捕获与连接效率，适配质量相对较高的低起始量样本。
   但两类策略均存在局限性：WGA可能引入污染与扩增偏倚，无扩增方案对样本质量与完整性要求严格。未来需开发适配所有类型法医样本（微量、降解、混合）的通用低起始量样本处理技术，突破纳米孔测序法医应用的投入量瓶颈。
   4.2 法医验证指南（SWGDAM/ISFG）合规性
   任何新型法医技术必须符合美国DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）与国际法医遗传学会（ISFG）的验证指南，核心验证指标包括灵敏度、特异性、重复性、混合/降解样本检测能力，是技术获得法医实践认可的基础。目前纳米孔测序的法医验证仍处于单实验室阶段，缺乏多实验室协作验证数据与统一验证方案，制约了其全球法医工作的大规模应用。
   单实验室验证已取得一定积极进展：研究人员证实其多标记检测体系符合SWGDAM核心要求（检测限100 pg DNA、重复性>99%、可检测1:10的两人混合样本）；基于MinION平台的法医物种鉴定完成了符合ISFG要求的验证。纳米孔测序符合国际法医验证指南的核心挑战包括：（1）不同纳米孔平台（ONT与QNome）及不同设备型号间的测序结果不一致，需统一数据分析标准与质量控制准则；（2）现场环境复杂（温度、湿度、粉尘等）导致现场测序结果不稳定，需通过优化便携式测序系统、开发现场适配反应方案解决；（3）缺乏用于验证的法医专用参考物质（如标准混合/降解DNA样本），需全球权威法医机构联合开发。未来研究需解决这些问题，推动纳米孔测序完全符合SWGDAM/ISFG指南，获得国际法医实践的认可。
   4.3 法医应用中的伦理与标准化问题
   纳米孔测序（尤其是现场实时测序）带来了此前研究未充分解决的伦理、数据安全与标准化挑战，随着现场法医检测技术的逐步发展，这些挑战日益凸显。
   4.3.1 伦理风险与对策
   现场纳米孔测序的快速实时数据生成带来三大核心风险，其中健康相关遗传数据意外检测的风险最为突出：纳米孔测序凭借超长读长可实现现场全基因组测序，在获取法医遗传标记的同时，极有可能检测到非法医遗传数据，如单基因遗传病致病突变、复杂疾病（心血管病、肿瘤等）易感位点、染色体异常等。这类意外检测可能导致遗传信息泄露与伦理争议，甚至侵犯被检测者隐私。
   针对上述伦理风险（尤其是健康相关遗传信息意外检测），提出针对性对策：（1）开发法医专用测序panel，将检测范围限定于法医相关遗传标记（如个体识别用STR、SNP，母系亲缘鉴定用mtDNA），排除疾病相关基因等非法医基因区域；（2）建立严格的数据过滤与掩码协议，在现场数据分析过程中自动识别并移除非目标遗传信息，避免人工访问与误用；（3）加强法医操作人员伦理培训，规范操作流程，确保符合国家与国际数据隐私法规，禁止将意外发现的遗传信息用于非法医目的。
   除上述风险外，现场测序还面临便携式计算设备加密不足导致遗传信息泄露、纳米孔设备便携简易导致非专业人员滥用技术等风险。对应对策包括：开发带端到端加密与多级访问控制的加密现场数据分析系统；将纳米孔测序设备列为法医专用设备，建立严格的准入与使用登记制度。
   4.3.2 标准化缺失与改进路径
   STR是全球法医DNA数据库（如CODIS）的核心遗传标记，不同硬件间缺乏统一的纳米孔STR分析流程标准化方案，是制约该技术广泛应用的关键因素。当前缺乏统一的检测方案与结果解读标准，导致不同实验室间STR基因分型结果不一致：例如不同碱基识别/纠错工具导致STR基因分型差异，混合样本解读尚无统一阈值。为解决这一问题，提出STR流程标准化的具体可行路径，以确保实验室间重复性与数据兼容性：（1）建立与全球法医数据库（如CODIS）完全对齐的纳米孔测序统一STR标记panel，确保纳米孔测序与传统检测技术的STR基因分型数据兼容；（2）明确法医STR分析的基准碱基识别工具与纠错工具（如高准确率碱基识别用Dorado、STR基因分型纠错用Medaka），减少平台间与算法间变异性；（3）使用国际标准参考物质（如9947A/9948对照DNA）制定实验室间校准方案，验证不同硬件（ONT MinION Mk1C、QNome-3841）的STR基因分型结果一致性；（4）制定统一的STR等位基因判读阈值与结果报告格式，规范基因分型准确率、混合样本检测限等关键指标的描述，确保检测结果的可重复性。
   除STR标准化外，全球权威法医机构需牵头制定一套完整的法庭科学纳米孔测序标准，包括：明确推荐试剂盒、平台、碱基识别工具与纠错工具；建立基因分型与混合样本解读的统一阈值；构建国家级/国际级法医纳米孔测序遗传标记参考数据库，为结果解读提供参考。
5. 5.
   展望与结论
   当前纳米孔测序技术在法庭科学中的应用仍面临一定挑战。法医学对检测结果的准确性与稳定性要求极高，现有纳米孔测序技术在低模板样本STR检测准确性、极端混合样本单倍型定相等方面仍有不足。尽管如此，研究人员已明确主要技术瓶颈，针对这些领域的定向优化，结合检测与分析技术的迭代升级，将推动纳米孔测序在法庭科学中的发展，最终实现其在公安工作中的实际应用。
   未来纳米孔测序在法庭科学中的研究与技术突破聚焦五大核心方向：（1）测序硬件与化学优化：开发更高准确率、更低投入需求的下一代测序芯片，优化测序反应体系，提升复杂野外环境下现场检测的稳定性；（2）法医专用生物信息学工具开发：开发适配法医样本的基于AI的自动碱基识别与单倍型定相工具，构建一键式法医遗传标记分析软件，降低操作人员技术门槛，提升数据分析结果的一致性；（3）低起始量与降解样本处理技术完善：整合WGA、分子条形码与低起始量文库构建技术，开发适配所有类型法医样本（微量、降解、混合）的通用处理方案，突破微克级投入瓶颈；（4）多实验室协作验证与标准化完成：加快推进符合SWGDAM/ISFG指南的纳米孔测序多实验室验证，制定国际统一的法医标准与检测方案，落实本研究提出的STR流程标准化路径，确保实验室间重复性与数据兼容性；（5）多组学检测整合：结合纳米孔DNA、RNA与甲基化测序，开发法医多组学平台，实现有限法医样本中遗传信息的全面提取，提升单次检测的信息产出量。
   综上，纳米孔测序技术在现场快速检测、长读长单倍型分析、表观遗传标记直接检测方面具有独特技术优势，是传统法医测序技术（CE与NGS）的有力补充。尽管其法医应用仍面临技术与非技术挑战（如低起始量样本处理、法医验证合规、伦理与标准化问题），但随着软硬件技术持续优化、多实验室法医验证完成、国际统一标准制定与实施，纳米孔测序技术有望在未来3–5年内广泛应用于常规法医工作，尤其在突发公共安全事件现场应急处置、依赖微量/降解样本的冷案积案侦查、涉及物种鉴定的野生动物犯罪检测中发挥关键作用，将成为法医遗传学的重要核心技术，为全球公安工作与司法公正提供更强大的技术支撑。