《BioTechniques》：Special approach of droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) for transgene stability of a Chinese hamster ovary (CHO) cell line
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哺乳动物细胞系的细胞系稳定性是生物制药生产中的一个重要关注点。通过多重荧光原位杂交（M-FISH）分析对单克隆抗体A（Mab A）的主细胞库（MCB）进行表征，研究人员鉴定了两种不同的核型细胞群体。因此，监管机构要求进行额外分析以支持MCB的单克隆谱系，并证明
哺乳动物细胞系的细胞系稳定性是生物制药生产中的一个重要关注点。通过多重荧光原位杂交（M-FISH）分析对单克隆抗体A（Mab A）的主细胞库（MCB）进行表征，研究人员鉴定了两种不同的核型细胞群体。因此，监管机构要求进行额外分析以支持MCB的单克隆谱系，并证明在随后衍生的细胞库中对两种细胞群体的控制。下一代测序（NGS）揭示了11个转基因整合位点序列。研究人员开发了一种多重（测量两个扩增子）液滴数字PCR（ddPCR）方法，并表征了MCB中这11个整合位点序列的拷贝数。对MCB的12个亚克隆进行分析显示，其中7个亚克隆至少缺失了五个特定整合位点中的一个。这五个不稳定位点在四个生产批次的生产末期细胞（EPC）中的表征与MCB一致。其他五个整合位点在所有克隆中的保守性支持这些细胞来自同一群体，并且不稳定整合位点的缺失导致了两种不同的核型群体。
论文解读文章：基于ddPCR的CHO细胞系转基因稳定性分析方法
研究背景、存在问题及研究意义
在生物制药生产中，细胞系稳定性和工艺一致性是确保单克隆抗体质量的关键因素。根据国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q5D指南，产品生命周期内高质量产品的保证至关重要。传统上，多重荧光原位杂交（M-FISH）被用于可视化主细胞库（MCB）中的转基因整合位点并监测转基因稳定性。然而，针对单克隆抗体A（Mab A）的CHO MCB进行M-FISH分析时，研究人员观察到细胞系中存在两种核型群体：群体1约占MCB细胞的75%，显示出两条染色体（长和短）整合了重链和轻链转基因；群体2约占25%，仅保留整合转基因的长染色体。监管机构据此要求额外分析以证明MCB为单克隆来源，并显示对随后衍生的细胞库中两种细胞群体的控制。因此，研究人员旨在开发一种替代M-FISH的方法，以更好地表征和定量两种群体比例，满足监管要求。本研究的意义在于提供一种更高效、特异的转基因稳定性监测手段，并通过整合位点拷贝数分析揭示细胞群体的遗传关系。
研究人员开展的研究及结论
研究人员首先采用下一代测序（NGS）鉴定了MCB中转基因整合的11个整合位点序列，然后开发并验证了一种多重液滴数字PCR（ddPCR）方法，用于测量这些整合位点的拷贝数。通过对MCB、12个亚克隆以及四个生产批次的生产末期细胞（EPC）进行分析，研究人员发现其中5个整合位点（IS1、IS2、IS3、IS7、IS9）为不稳定标记，其拷贝数在不同亚克隆中发生缺失，且这些不稳定位点在EPC中与MCB保持一致的拷贝数谱，表明群体比例稳定。研究结论表明，NGS与ddPCR联合应用提供了一种稳健、可重复的检测方法，能够定量监测转基因整合特征，支持了MCB中两种群体遗传相关且来自同一克隆的假设，并成功满足了监管机构的要求。该论文发表在《BioTechniques》。
主要关键的技术方法
研究人员使用下一代测序（NGS）对CHO DG44 fut8
?/? MCB的基因组DNA进行靶向捕获和测序，鉴定了11个转基因整合位点（包括重链和轻链质粒与宿主基因组的连接点）。随后基于这些序列设计ddPCR引物和探针，以β-2-微球蛋白（B2M）为内参基因，开发了多重ddPCR（测量两个扩增子：目标整合位点和B2M）方法，用于定量每个整合位点的每细胞拷贝数。样本队列包括CHO DG44 fut8
?/? MCB、通过荧光激活单细胞分选（FACS）从MCB获得的12个亚克隆（编号13-24），以及来自四个独立生产批次的EPC。无需提及试剂和具体培养步骤。
研究结果
3.1 M-FISH of CHO Mab A MCB：通过M-FISH分析发现Mab A的MCB中存在两种核型群体：群体1（约75%）显示两条染色体（长和短）整合了转基因，群体2（约25%）仅保留长染色体。研究人员推测群体2源自群体1并随后丢失了短染色体上的整合。
3.2 Characterization of the integration sites in the MCB：通过ddPCR测量MCB中11个整合位点的每细胞拷贝数，结果范围为0.16至11.73。所有整合位点均检测到阳性液滴，验证了引物和探针的有效性，并表明MCB群体在所有位点均存在转基因插入。
3.3 Characterization of the integration sites for 12 subclones：对12个亚克隆的11个整合位点的每细胞拷贝数分析显示，6个位点（IS1、IS2、IS3、IS7、IS9、IS10）不稳定或未保守，其中IS10在所有亚克隆中拷贝数均低，因此未选为筛选标记。3个位点（IS5、IS6、IS8）在所有亚克隆中保守且拷贝数一致（除亚克隆15在IS6丢失）。IS4和IS11高度保守但拷贝数变异大，且在对照细胞系Mab B中也呈强阳性，提示存在脱靶扩增，故未选为标记。最终，5个位点（IS1、IS2、IS3、IS7、IS9）被选为监测工作细胞库（WCB）和EPC中整合不稳定性的标记。
3.4 End of production cells (EPCs) for Mab A manufacturer exhibited a consistent ratio in unstable integration sites：检测四个生产批次EPC及细胞老化EPC中五个标记整合位点的每细胞拷贝数，结果显示这些EPC的整合位点谱与MCB及细胞老化EPC相对一致，仅存在微小差异，表明不同批次间重链和轻链转基因相对稳定，整合位点标记谱一致，从而证明了群体比例稳定且受控。
总结讨论与研究结论翻译
讨论部分强调，生物治疗产品的产品质量和生产一致性对于患者安全和药效至关重要，而一致的细胞系性能和稳定性是维持产品质量的重要方面。CHO基因组的可塑性使得细胞系在从MCB到EPC的传代中难以保持均一。已有研究采用重链（HC）和轻链（LC）转基因拷贝数分析来探讨基因拷贝数与生产力的相关性，以及分析整合位点序列，但尚未有对MCB、亚克隆和EPC进行整合位点基因拷贝数分析的报道。M-FISH在定量比较和确定群体间主要差异方面存在局限性。ddPCR作为一种新技术，相比实时PCR能够更精确地定量DNA和RNA，且时间和成本效率更高。利用整合位点序列进行拷贝数分析比总HC/LC质粒DNA拷贝数检测更具特异性，可特异性监测转基因在CHO基因组中的定位。本研究中NGS和ddPCR的结合提供了稳健且可重复的检测方法，支持了MCB中群体遗传相关且来自同一克隆的假设。此外，该ddPCR方法可轻松用于未来WCB和EPC的评估，证明MCB群体及其比例在后续细胞库中保持一致且受控，甚至长期传代后仍稳定，满足了监管机构的要求。研究结论翻译如下：这种NGS测序与ddPCR分析相结合的特殊方法，提供了一种稳健且可重复的检测方法，能够经过验证，对Mab A生产细胞系中的转基因整合进行定量监测和表征。这些数据支持MCB中观察到的群体在遗传上相关且源自同一克隆的假设。此外，这项工作提供了一种易于再次使用的ddPCR检测方法，用于继续评估源自Mab A MCB的未来WCB和EPC。研究结果对MCB群体及其比例在后续细胞库中保持一致且受控提供了信心，甚至如细胞老化EPC结果所示，在长期传代后也是如此。这证明了细胞系的稳定性以及对细胞系开发过程的控制，并满足了监管机构的要求。
