预防性甘草酸通过HMGB1-TLR4通路调节减轻七氟烷手术诱导的中年小鼠识别记忆缺陷和神经炎症

《International Journal of Neuroscience》：Prophylactic glycyrrhizin attenuates sevoflurane-surgery-induced recognition memory deficit and neuroinflammation in middle-aged mice via HMGB1-TLR4 pathway modulation

　　

背景 围手术期神经认知障碍（PNDs）包括延迟的神经认知恢复（dNCR；≤30天）和术后神经认知障碍（NCD；>30天）。尽管HMGB1-TLR4/NF-κB轴驱动急性神经炎症，但急性期后的时间动态以及HMGB1与TLR4在dNCR向NCD转变中的不同作用仍不清楚。本研究探讨了甘草酸是否通过HMGB1-TLR4调节减轻七氟烷手术诱导的识别记忆缺陷。方法 8月龄雄性C57BL/6J小鼠在长时间七氟烷麻醉（3%，2小时）下接受右颈总动脉分离术，伴或不伴甘草酸预处理（30 mg/kg，腹腔注射；批次1每组n=15，批次2每组n=7）。通过旷场实验、新物体识别实验、Y迷宫实验和Morris水迷宫实验评估认知功能。在术后第7天和第20天评估海马神经炎症、HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路、突触蛋白和尼氏染色。结果 长时间七氟烷暴露联合手术诱导了识别记忆损伤和平台穿越次数减少，两者均被甘草酸减轻。虽然外周IL-6在第7天恢复正常，但海马细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）和胶质细胞活化持续至第20天。HMGB1在第7天升高，但第20天恢复正常，而TLR4/NF-κB在两个时间点仍保持升高；甘草酸抑制了这一级联反应。突触蛋白减少，CA3/齿状回在第7天和第20天出现尼氏染色减少，甘草酸提供了保护，而CA1未见显著改变。结论 这些发现表明，在中年小鼠七氟烷手术后，HMGB1正常化与持续的TLR4/NF-κB激活之间存在时间分离。预防性甘草酸可减轻识别记忆缺陷并抑制海马神经炎症，尽管机制推断仍属推测，需严格验证。

## 论文解读：预防性甘草酸通过HMGB1-TLR4通路调节减轻七氟烷手术诱导的中年小鼠识别记忆缺陷和神经炎症

### 研究背景与目的

围手术期神经认知障碍（PNDs）是术后常见并发症，包括延迟的神经认知恢复（dNCR，术后≤30天）和术后神经认知障碍（NCD，>30天）。在非心脏大手术后，中年患者（40-59岁）中dNCR的发病率在出院时高达30.4%，而3个月时仍有5.6%的患者存在认知损伤，提示急性围手术期损伤可能进展为慢性认知缺陷。然而，现有干预措施主要针对急性期（术后0-7天），对dNCR和NCD的机制及预防手段认识不足。此外，多数机制研究聚焦于急性炎症（≤7天），而对长期术后认知功能障碍的时间演变特征刻画尚不充分。因此，在外周炎症信号消退后，何种内源性机制维持亚急性至慢性转变期的中枢神经炎症尚不清楚。

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）-Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）的激活被认为是急性神经炎症反应的关键通路。然而，该轴在亚急性至慢性转变期的纵向激活模式仍不明确，尤其是HMGB1-TLR4信号是否在急性期后持续存在以维持dNCR和NCD期间的神经炎症。七氟烷麻醉可诱导神经元和胶质细胞快速释放HMGB1，进而激活TLR4依赖性炎症级联反应，参与急性神经毒性。甘草酸（一种从甘草根中提取的天然三萜皂苷）在多种损伤模型中通过特异性抑制HMGB1显示出急性神经保护作用，但其预防性应用于七氟烷诱导的神经毒性以及能否在亚急性和慢性期发挥疗效尚待探索。本研究旨在探讨预防性甘草酸给药能否通过抑制持续HMGB1-TLR4激活，阻断亚急性至慢性神经炎症的转变并保护突触功能。

### 主要关键技术方法

研究人员使用8月龄雄性C57BL/6J小鼠（相当于人类中年），在长时间七氟烷麻醉（3%，2小时）下进行右颈总动脉分离术，建立手术联合麻醉的双重打击模型。甘草酸（30 mg/kg，腹腔注射）于麻醉诱导前1小时给药。通过旷场实验、新物体识别实验、Y迷宫实验和Morris水迷宫实验评估认知功能。在术后第7天和第20天收集海马组织，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）、Western blot（WB）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞因子水平及信号通路蛋白表达，并通过免疫荧光和尼氏染色观察胶质细胞活化、神经元及突触结构。

### 研究结果

**3.1 长时间七氟烷暴露联合手术创伤损害识别记忆并降低平台搜索效率，而甘草酸预处理可改善识别记忆缺陷**
通过旷场实验、新物体识别实验、Y迷宫实验和Morris水迷宫实验评估。结果显示，长时间七氟烷麻醉（2小时）联合手术组（Sev组）的新物体识别指数显著低于对照组（Ctrl组），平台穿越次数也显著减少，而甘草酸预处理（Sev+GLY组）显著恢复了这些指标。旷场实验中各组运动能力无差异，Y迷宫自发交替率无显著变化，Morris水迷宫目标象限时间无差异，表明选择性识别记忆受损而非全面认知下降。

**3.2 长时间七氟烷暴露联合手术创伤诱导外周和海马神经炎症，而甘草酸预处理发挥抗炎作用**
血清白介素-6（IL-6）在术后6小时显著升高，术后7天恢复正常，呈现一过性外周炎症。海马IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在术后第7天和第20天均显著升高，Sev组显著高于Ctrl组，甘草酸预处理显著降低这些细胞因子水平。免疫荧光显示，海马CA3区离子钙结合适配分子1（Iba-1）阳性小胶质细胞和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞在术后第7天和第20天均显著增多，甘草酸预处理抑制了胶质细胞活化。

**3.3 甘草酸抑制海马HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路及相关的神经炎症**
Western blot和RT-qPCR分析显示，术后第7天，Sev组海马HMGB1蛋白和mRNA表达显著升高，TLR4蛋白和mRNA表达升高，磷酸化p65（p-p65）及p-p65/总p65比值升高，甘草酸预处理显著抑制这些变化。术后第20天，HMGB1蛋白和mRNA在各组间无显著差异，但TLR4蛋白和mRNA仍显著升高，p-p65及p-p65/总p65比值仍显著升高，甘草酸仍能抑制TLR4和p-p65水平。这表明HMGB1在亚急性期升高后恢复正常，而TLR4/NF-κB持续激活，甘草酸抑制了该级联反应。

**3.4 长时间七氟烷暴露联合手术创伤诱导海马组织学改变和突触蛋白丢失，而甘草酸预处理保护突触和神经元完整性**
NeuN免疫荧光显示CA3、CA1和齿状回（DG）区域神经元密度无显著差异。尼氏染色显示，Sev组CA3和DG区尼氏阳性神经元数量在术后第7天和第20天显著减少，甘草酸预处理显著增加；CA1区尼氏染色无显著变化。突触蛋白免疫荧光和Western blot显示，Sev组海马突触素（SYP）和突触后密度蛋白-95（PSD-95）表达在术后第7天和第20天均显著降低，甘草酸预处理显著恢复这些蛋白水平。这表明长时间七氟烷手术诱导CA3和DG区的组织学改变及全海马突触蛋白丢失，甘草酸提供保护。

### 讨论与结论

**讨论总结**：研究发现，长时间七氟烷麻醉联合手术在中年小鼠中引起选择性识别记忆缺陷，而甘草酸预处理可改善该缺陷。海马HMGB1-TLR4/NF-κB信号通路呈现时间分离：HMGB1在第7天升高后于第20天恢复正常，而TLR4/NF-κB持续激活至第20天。这表明早期HMGB1释放可能启动了一个自我维持的炎症级联反应，超越其自身升高的持续时间。甘草酸通过直接结合HMGB1的DNA结合域，阻止其细胞外释放及与TLR4的相互作用，从而抑制该通路。研究还发现，海马CA3和DG区对损伤更敏感，表现为尼氏染色减少，而CA1区相对耐受。突触蛋白（SYP和PSD-95）的丢失与认知缺陷和神经炎症相关，甘草酸保护了突触完整性。

**结论翻译**：总之，本研究表明，预防性甘草酸可减轻中年小鼠七氟烷手术诱导的识别记忆缺陷，同时抑制海马HMGB1-TLR4/NF-κB信号通路并保护突触蛋白表达。这些发现支持围手术期靶向HMGB1干预治疗术后认知功能障碍的可行性，但机制推断仍属推测，在进行临床转化前需要严格验证。