尿酸通过Nrf2信号通路抵抗铁死亡（Ferroptosis）减轻LPS诱导的BV2细胞及MPTP诱导的PD小鼠炎症反应

《Redox Report》：Uric acid alleviates the inflammatory response in LPS-induced BV2 cells and MPTP-induced PD mice by resisting ferroptosis through the Nrf2 signalling pathway

　　

背景 神经炎症、氧化应激及铁死亡（Ferroptosis）均参与帕金森病（Parkinson's disease, PD）的发病机制。流行病学研究表明，尿酸（Uric acid, UA）水平升高可能降低PD风险，但其确切分子机制尚不清楚。在本研究中，研究人员探讨了UA在脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）或1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP⁺）刺激的BV2小胶质细胞以及1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD小鼠模型中的作用。方法 BV2细胞被公认为机制探索的标准化且可重复的神经炎症细胞模型。研究人员在LPS或MPP⁺刺激的BV2小胶质细胞及MPTP诱导的PD小鼠模型中评估了UA的抗铁死亡及抗炎效应。采用蛋白质印迹（Western blot）、实时定量PCR（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）及免疫荧光技术分析炎症小体相关标志物的表达。活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）及Fe²⁺水平采用检测试剂盒测定，线粒体超微结构通过透射电子显微镜（TEM）评估。PD相关标志物通过行为学及免疫组织化学方法评估。采用Nrf2抑制剂ML385验证通路特异性。结果 研究人员发现UA处理可降低BV2小胶质细胞中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达、ROS产生、脂质过氧化及细胞内Fe²⁺水平，同时增强抗氧化能力并维持线粒体超微结构。在MPTP处理的小鼠中，UA改善了运动功能，保留了黑质致密部多巴胺能神经元密度，并减轻了神经炎症。UA激活了Nrf2信号并上调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达，这些效应被ML385减弱，证实了上述效应的Nrf2依赖性。结论 UA通过激活Nrf2信号通路，减轻LPS或MPP⁺刺激的BV2小胶质细胞及MPTP诱导的PD小鼠模型中的铁死亡和神经炎症。

帕金森病（Parkinson's disease, PD）作为全球第二大常见神经退行性疾病，其发病率随人口老龄化持续攀升。该病以黑质致密部多巴胺能神经元的进行性退变及细胞内路易小体（主要由α-突触核蛋白聚集形成）的堆积为特征，临床除运动迟缓、肌强直及静止性震颤等经典运动症状外，患者常伴有认知功能下降、情绪障碍及自主神经功能障碍，严重影响生活独立性并加重医疗负担。现有证据表明神经炎症在PD进展中扮演关键角色，小胶质细胞的异常激活可导致持续性神经元损伤与功能障碍。小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，在维持脑稳态及应对损伤或感染中发挥重要作用，在病理条件下可向促炎型M1表型或抗炎型M2表型极化。PD中小胶质细胞激活偏向M1表型，促成慢性神经炎症及多巴胺能神经元丢失，因此调控小胶质细胞极化被视为有前景的治疗策略。

氧化应激在PD发病机制中至关重要。近年来，铁死亡（Ferroptosis）作为一种新型程序性细胞死亡方式，以铁积累及脂质过氧化为特征，在PD中的作用日益受到关注。研究表明，铁沉积（尤其黑质部位）可改变小胶质细胞基因表达，促进其向促炎表型转化并增加活性氧（ROS）产生；反之，激活的小胶质细胞通过调控铁转运蛋白加剧神经元铁失衡。值得注意的是，小胶质细胞较神经元或星形胶质细胞对铁诱导的氧化应激更为敏感，使其更易发生铁死亡。这种铁死亡与炎症相互强化的恶性循环可能驱动PD进展。核因子红细胞系2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）是调控抗氧化反应的关键转录因子，通过上调谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4, GPX4）等基因发挥抗铁死亡保护作用。UA作为嘌呤代谢终产物，具有激活Nrf2通路的潜力，但UA在PD中调控铁死亡的精确分子机制尚不清楚。

该研究发表于《Redox Report》，旨在探讨UA在PD实验模型中的神经保护作用，特别关注铁死亡及小胶质细胞极化。研究人员采用LPS或MPP⁺刺激的BV2小胶质细胞以及MPTP诱导的小鼠PD模型，评估铁死亡相关标志物、炎症因子、线粒体形态、多巴胺能神经元完整性及运动功能，以阐明UA通过激活Nrf2信号通路发挥抗铁死亡及抗炎效应的机制。

主要技术方法包括：BV2小胶质细胞培养与药物处理体系；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力；NO、乳酸脱氢酶（LDH）及ELISA测定炎症因子；特定试剂盒检测ROS、MDA、GSH及Fe²⁺水平；TRIzol提取总RNA后反转录，SYBR Green法进行qPCR分析；Western blot检测蛋白表达；透射电子显微镜观察线粒体超微结构；免疫荧光及免疫组织化学分析细胞表型与组织定位；以及包括爬杆试验和悬挂试验在内的行为学评估。动物实验采用广西医科大学动物研究中心提供的25只雄性C57BL/6J小鼠（6周龄，18–22 g），随机分为对照组、MPTP组、MPTP+UA低剂量组、MPTP+UA中剂量组及MPTP+UA高剂量组；后续机制验证另取20只小鼠分为对照组、MPTP组、MPTP+UA组及ML385+UA+MPTP组。

研究结果部分如下：

LPS诱导BV2小胶质细胞神经炎症及铁死亡标志物：CCK-8检测显示1 μg/mL LPS显著降低BV2细胞活力；LPS激活小胶质细胞，显著增加IL-1β、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及IL-6的mRNA水平及NO释放。铁死亡评估显示，LPS剂量依赖性增加细胞内Fe²⁺及MDA水平、ROS产生，降低GSH含量及GPX4的mRNA和蛋白表达，证实LPS诱导的神经炎症与铁死亡激活密切相关。

Fer-1通过抑制铁死亡减轻LPS诱导的神经炎症：特异性铁死亡抑制剂Fer-1（10 μM）有效抑制LPS诱导的铁死亡，表现为Fe²⁺和MDA水平降低、GSH水平及GPX4 mRNA表达升高；同时显著抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平及其在培养上清中的释放。

UA抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞神经炎症及铁死亡：200 μM UA显著减少LPS诱导的LDH释放；qPCR显示UA显著抑制iNOS、IL-1β和TNF-α表达，ELISA证实培养上清中IL-1β和TNF-α水平降低；免疫荧光显示UA显著抑制M1型标志物CD86的表达；Western blot证实UA抑制COX-2蛋白表达。铁死亡指标方面，UA降低Fe²⁺和MDA水平，升高GSH水平，减少ROS产生，并恢复LPS抑制的GPX4蛋白及mRNA表达。

UA转运体阻断破坏其抗炎及抗铁死亡功能：UA转运体抑制剂丙磺舒（PBN）显著逆转UA介导的炎症因子表达抑制；透射电镜显示PBN加剧UA改善的线粒体损伤，抵消UA对Fe²⁺、MDA、GSH及GPX4的调控作用，证实UA的神经保护效应依赖于浓度及细胞内UA水平。

UA通过激活Nrf2通路在BV2小胶质细胞中发挥神经保护作用：LPS降低Nrf2 mRNA及蛋白表达，UA有效逆转此效应，而Nrf2特异性抑制剂ML385 abolished UA诱导的Nrf2激活。ML385同时上调IL-1β、TNF-α和IL-6表达，逆转UA的抗炎效应，并削弱UA对Fe²⁺积累、MDA水平、GSH含量及GPX4表达的调控作用。

UA抑制MPP⁺诱导的BV2小胶质细胞神经炎症及铁死亡：MPP⁺处理上调TH表达，UA预处理显著减弱此效应；UA显著抑制MPP⁺诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α表达，降低Fe²⁺和MDA水平，增强GSH含量，并下调SLC7A11和GPX4 mRNA表达，部分恢复Nrf2 mRNA水平。

UA通过抑制神经炎症及铁死亡改善运动功能障碍并保护多巴胺能神经元：行为学评估显示MPTP处理小鼠爬杆潜伏期延长、悬挂评分降低，UA剂量依赖性改善运动功能，200 mg/kg效果最显著。免疫组织化学显示UA有效减缓MPTP导致的黑质致密部TH⁺神经元丢失；UA剂量依赖性抑制Iba-1上调及CD86⁺小胶质细胞荧光强度，并逆转MPTP诱导的GPX4下调。

UA激活Nrf2信号抑制PD小鼠铁死亡及神经炎症：UA显著增加黑质组织TH蛋白及mRNA表达，此效应被ML385部分阻断；UA抑制MPTP诱导的Iba-1、IL-1β和IL-6 mRNA升高，ML385部分逆转其抗炎效应。UA逆转MPTP增加的Fe²⁺水平，ML385削弱此效应。UA逆转MPTP降低的GPX4蛋白及mRNA表达、Nrf2蛋白及mRNA表达，ML385均削弱这些效应。

讨论部分总结如下：

PD发病机制涉及氧化应激、神经炎症及铁死亡的复杂相互作用。UA作为嘌呤分解代谢终产物，具有强效抗氧化特性并能穿过血脑屏障，其神经保护分子机制尚不明确。该研究数据表明，UA通过增强抗氧化防御、激活Nrf2信号通路并恢复谷胱甘肽稳态，抑制脂质过氧化并限制铁死亡驱动的炎症信号，最终减少小胶质细胞激活及神经炎症。

研究支持铁死亡与神经炎症的 mechanistic framework（机制框架）：LPS或MPP⁺触发炎症后，铁稳态破坏导致细胞内铁过载及ROS过度产生，伴随GPX4表达降低及MDA等脂质过氧化产物增加。Fe²⁺促进Fenton反应，启动磷脂过氧化并生成脂质衍生活性醛类；铁死亡损伤触发损伤相关分子模式（DAMPs）释放，激活模式识别受体，(E)-N-乙基-2-{2-[(4-甲氧基苯基)氨基]噻唑-4(5H)-亚基}-2-氰基乙酰胺等信号，最终促进TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子产生，形成自我强化的恶性循环。Fer-1通过抑制铁死亡减轻炎症损伤，但其对MDA的效应相对温和，因MDA为下游累积性读数，且LPS驱动的氧化损伤涉及NADPH氧化酶激活、线粒体ROS产生等非铁死亡机制。

UA此前被报道抑制NLRP3炎症小体激活及caspase-1依赖的IL-1β和IL-18成熟，保护多巴胺能神经元免受6-羟基多巴胺或MPP⁺诱导的死亡。该研究首次揭示UA在神经炎症条件下调控铁死亡的机制：UA有效减弱M1型小胶质细胞极化，抑制CD86、COX2和Iba-1表达及TNF-α、IL-6和NO释放；在MPTP诱导的PD小鼠中改善运动缺陷并保护多巴胺能神经元。PBN阻断UA经URAT1/GLUT9转运体的跨膜运输后，UA的抗炎及抗铁死亡效应显著减弱，揭示转运系统对UA生物活性的调控作用。Nrf2作为氧化应激及铁死亡的主转录调控因子，该研究证实UA通过激活Nrf2信号通路抑制神经炎症及铁死亡；ML385显著 abolished UA的神经保护效应 notably，凸显Nrf2在介导UA效应中的核心作用。UA上调Nrf2及其下游GPX4表达，恢复GSH浓度，减少MDA等脂质过氧化产物积累。

研究局限性包括：MDA作为下游累积性氧化结局指标，其动态变化可能滞后于铁死亡膜损伤；BV2细胞替代原代小胶质细胞限制生理相关性；Nrf2抑制剂特异性有限，影响机制推断强度；UA来源的药理学特征尚不完整，影响可重复性及转化应用。后续研究应结合Nrf2缺陷模型及多组学分析，精确阐明UA调控铁死亡的机制，并建立严谨的剂量效应关系；治疗开发应优先选择中枢靶向UA衍生物或先进给药策略以改善安全性。

研究结论：该研究证实UA通过激活Nrf2信号通路，减轻PD模型中的铁死亡介导的神经炎症。这些发现阐明了UA发挥抗炎及抗铁死亡效应的多方面机制，凸显其作为靶向神经炎症性疾病多种病理过程治疗药物的潜力。