《Biotechnology and Bioengineering》：A Practical Gut-On-Chip Workflow for Imaging-Based Assessment of Epithelial Barrier Dynamics During E. coli Co-Culture
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研究人员开发并验证了一种实用的肠芯片工作流程，能够通过基于成像的方式，定量评估与大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）短期共培养过程中的上皮屏障动态。肠道上皮及其驻留的微生物群构成了一个动态界面，对肠道稳态至关重要，但这一界面难以用传统工
研究人员开发并验证了一种实用的肠芯片工作流程，能够通过基于成像的方式，定量评估与大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）短期共培养过程中的上皮屏障动态。肠道上皮及其驻留的微生物群构成了一个动态界面，对肠道稳态至关重要，但这一界面难以用传统工具建模。静态Transwell培养缺乏生理性流体剪切力，而动物模型成本高昂且不适合定量、高内涵成像。器官芯片（Organ-on-a-chip）技术提供了一种重现肠道关键物理和生物学特征的方法，然而许多现有的肠芯片系统仍存在技术门槛高或标准化不足的问题，难以常规使用。在此，研究人员开发并验证了一种实用的肠芯片工作流程，该流程能够实现可重复的、基于成像的定量分析，用于研究与大肠杆菌（E.coli）短期共培养过程中的上皮屏障动态。使用商业化的双通道微流控芯片和Caco-2细胞，研究人员首先在低流速条件（0.5–1 μL/min）下建立了一个灌注的肠道模型，并通过相差显微镜、活/死（LIVE/DEAD）染色以及针对闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、F-肌动蛋白（F-actin）和麦胚凝集素（WGA）的免疫荧光染色，确认了其长期稳定性。该流程产生了汇合、极化的单层细胞，具有连续的紧密连接和顶端的糖蛋白黏液层。随后，研究人员引入HADA标记的大肠杆菌（E. coli），并在共培养期间系统性地改变灌注速率。在0.5 μL/min的流速下，虽然单独培养时上皮层稳定，但在共培养4天内迅速变薄并出现局灶性脱落，表明低剪切力不足以缓冲细菌过度生长和代谢产物积累。相比之下，Caco-2单层细胞能够耐受高达10 μL/min的灌注而无结构损伤，并且在此较高流速下，研究人员获得了一个稳定的、24小时的分析窗口，在此期间可以可靠地成像上皮完整性和细菌分布。只有当共培养延长至4天和7天时，结构破坏才变得明显。综上所述，这些结果确定了灌注速率是稳定肠芯片平台上宿主-微生物共培养的关键参数。本文描述的工作流程将经过功能验证的上皮屏障与实验简单但稳健的灌注方案相结合。它为研究早期宿主-微生物相互作用的定量研究提供了一个可及的测试平台，并且可以随时通过正交屏障读数（如跨上皮电阻（TEER）或示踪剂渗透性）进行扩展，用于未来的工作。
研究背景：肠道上皮作为单细胞层屏障，需平衡营养吸收与防御菌群入侵的功能，这一平衡依赖于上皮细胞、顶端黏液层及细胞间紧密连接的动态调控，并受肠道微生物和局部免疫信号影响。屏障功能障碍被认为是炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）等疾病的核心特征。然而，研究真实肠道物理和生化微环境下的屏障动力学依然困难。传统的体外模型（如静态Transwell培养的Caco-2单层）缺乏生理性流体剪切力，导致上皮极化异常、黏液周转受阻及微生物定植空间控制不佳，且与细菌共培养时易因营养消耗、代谢毒物积累和细菌过度生长而破坏上皮，无法反映真实生物学过程。动物模型虽具系统性，但存在种间差异、菌群组成难以控制、伦理限制及不适合高内涵成像等局限性。器官芯片（OoC）技术，特别是肠芯片，通过在微流控平台中模拟灌注和机械拉伸等物理条件，弥补了上述模型的不足。尽管已有多种肠芯片设备用于模拟绒毛形成、黏液分泌和微生物定植，但许多现有平台涉及定制化器件制造、复杂真空驱动蠕动机制或厌氧基础设施，技术门槛高且标准化不足，难以在临床导向实验室中广泛应用。此外，尽管已知流体剪切力促进肠道屏障功能，但灌注条件与宿主-微生物共培养稳定性之间的具体关系尚不完全明确。因此，开发一种方法简单、定量稳健、且能与高内涵成像兼容的实用肠芯片工作流程，对于研究早期宿主-微生物相互作用，并桥接基础微生物组研究与临床转化应用具有重要意义。为此，研究人员开展本研究，旨在利用商业化双通道微流控芯片和标准Caco-2细胞系，建立可重现的、具备功能性成熟上皮屏障的灌注模型，并系统优化灌注速率以稳定细菌共培养，最终实现基于成像的屏障动力学定量评估。该研究发表在《Biotechnology and Bioengineering》。
关键技术与方法：研究人员采用了商业化双通道器官芯片平台（Anivance AI Corporation, Hsinchu, Taiwan），该平台包含由多孔膜分隔的平行微通道。关键方法包括：1）微流控芯片的胶原蛋白（type I collagen）涂层处理，以促进上皮细胞附着；2）Caco-2细胞（ATCC HTB-37）在微流控芯片中的动态灌注培养，以建立成熟的上皮屏障；3）利用7-羟基香豆素-氨基-D-丙氨酸（HADA）荧光标记大肠杆菌（E. coli）（BCRC 14902），用于显微镜追踪；4）通过相差显微镜、活/死（LIVE/DEAD）染色、针对闭锁小带蛋白-1（ZO-1）和F-肌动蛋白（F-actin）的免疫荧光染色以及麦胚凝集素（WGA）染色进行成像分析与表征。
研究结果：
3.1 低流速灌注下稳定长期上皮单培养：在0.5或1 μL/min的连续灌注下，Caco-2细胞形成并维持汇合的单层膜至少至14天。LIVE/DEAD染色显示第7天和14天时细胞活力高，表明该流速条件在无细菌时对上皮层无显著应激。
3.2 灌注单层细胞呈现紧密连接、极化和顶端黏液层：共聚焦成像显示，ZO-1在细胞边界呈连续环状分布，F-肌动蛋白在顶端表面形成致密的刷状缘结构，证实了细胞极化和良好形成的紧密连接。WGA染色确认了顶端表面有均匀的糖蛋白/黏液层覆盖。
3.3 低流速灌注不足以维持与大肠杆菌（E. coli）共培养时的上皮完整性：在0.5 μL/min流速下引入HADA标记的E. coli后，共培养至第4天，相位差成像显示上皮单层出现局部变薄和部分脱落，至第7天缺陷扩大。这表明低流速条件下，细菌的存在触发了上皮结构崩溃。
3.4 Caco-2单层细胞耐受更高灌注速率且无活力损失：在2和10 μL/min的单培养条件下，Caco-2细胞形成汇合单层，且在10 μL/min条件下，细胞形态更致密均一，第7天的免疫荧光染色证实F-肌动蛋白组织和核形态保存良好，表明Caco-2细胞可耐受甚至受益于适度增加的剪切应力。
3.5 高流速灌注为宿主-微生物相互作用提供稳定的24小时分析窗口：在10 μL/min流速下进行E. coli共培养，24小时后上皮单层结构完整，无变薄或脱落。然而，当共培养延长至第4天和第7天，出现渐进性结构变化，如单层均匀性下降和细胞密度降低。这定义了当前系统的一个实用操作极限：一个稳定、可重复的24小时定量成像窗口，用于研究早期宿主-微生物相互作用。
讨论与结论总结：本研究开发并验证了一套方法简单、可重复的肠芯片工作流程，该流程将功能成熟的Caco-2上皮屏障与经过系统优化的用于大肠杆菌（E. coli）共培养的灌注方案相结合。研究发现灌注速率是决定共培养稳定性的关键设计参数：低流速（0.5 μL/min）虽能维持单培养，但在细菌存在下迅速导致上皮退化；而较高流速（10 μL/min）则能提供至少24小时的稳定分析窗口。这一窗口非常适合研究细菌粘附、早期紧密连接重塑及快速上皮应激反应。研究结论指出，这些发现突显了灌注速率是肠芯片实验中的一个关键且常被忽略的参数。本研究提供的实用工作流程降低了临床导向实验室采用微流控肠道模型的门槛，并可轻松扩展至更复杂的细胞类型、微生物群落和定量读数。从长远来看，此类可及的肠芯片系统可能有助于桥接实验室实验与针对微生物驱动的胃肠道疾病患者的个性化治疗策略。
