基于最可能数法并采用验证性qPCR的禽类环境粪便中肠炎沙门氏菌婴儿血清型定量方法的开发与验证

《Frontiers in Microbiology》：Development and validation of a quantitative method for the enumeration of Salmonella enterica serovar Infantis from environmental poultry feces based on most probable number approach followed by confirmatory qPCR

　　

肠炎沙门氏菌婴儿血清型（Salmonella enterica serovar Infantis）在过去二十年间已成为欧盟（EU）肉鸡生产中的优势血清型。由于在家禽中通常无症状定植，多药耐药（MDR）菌株可在鸡群内无声传播，导致肉制品污染，并引发重大的“同一健康”（One Health）关注。在意大利，S. infantis占肉鸡中沙门氏菌分离株的90%以及人类病例的约40%，突出了改进监测工具以支持风险管理策略的必要性。定量微生物风险评估（QMRA）方法需要准确可靠的定量数据。为此，研究人员开发并验证了一种快速且特异的方法，用于定量禽类环境粪便样本中的S. infantis。该方法基于从ISO 6579-2改编的小型化最可能数（MPN）方法，并结合了通过S. infantis特异性qPCR检测进行的确认。利用Bland–Altman方法评估了与禽类环境粪便相关的基质效应。使用加标样本和自然污染样本评估了方法性能，包括重复性和再现性。确认性qPCR的高分析特异性确保了方法的特异性。当应用于自然污染样本时，该方法证明了其在禽类环境粪便中定量S. infantis载量的适用性，为基于QMRA的干预措施和肉鸡生产系统内的监测策略提供了稳健数据。

# 论文解读：基于MPN-验证性qPCR的禽类环境粪便中肠炎沙门氏菌婴儿血清型定量方法的开发与验证

## 研究背景与目的

肠炎沙门氏菌婴儿血清型（Salmonella enterica serovar Infantis，S. infantis）在过去二十年中已成为全球家禽产业的关键威胁。该血清型在欧盟（EU）肉鸡生产中占主导地位，在意大利肉鸡中占沙门氏菌分离株的90%，并引起约40%的人类病例。由于S. infantis能在禽类中无症状定植，多药耐药（MDR）菌株可通过pESI-like大质粒（携带广谱β-内酰胺酶（ESBL）等耐药基因）在鸡群中隐蔽传播，导致肉制品污染，构成“同一健康”（One Health）挑战。目前，定量微生物风险评估（QMRA）框架需要准确、可靠的定量数据以支持风险管理策略，但现有方法在复杂环境粪便基质中缺乏针对S. infantis的高特异性定量工具。因此，研究人员开发并验证了一种快速、特异的方法，用于定量禽类环境粪便中的S. infantis，以支撑基于QMRA的干预和监测策略。

## 研究内容与结论

研究人员基于ISO 6579-2的小型化最可能数（MPN）方法，结合S. infantis特异性验证性qPCR，建立了一套量化流程。通过加标和自然污染样本评估了方法性能，包括重复性、再现性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。Bland–Altman分析评估了粪便基质的抑制效应。该方法在13个意大利肉鸡农场（位于艾米利亚-罗马涅大区Forlì省）采集的96份环境粪便样本中进行了适用性测试。结果表明，该方法能检测0.95 log₁₀ MPN/g以上至5.25 log₁₀ MPN/g的S. infantis载量，变异系数（CV）通常低于10%，具有良好的重复性和再现性。基质引入约0.64 log₁₀的偏差但可预测，LOQ仍符合ISO标准。该方法为QMRA提供了稳健数据，有助于评估感染动态和干预措施效果。论文发表在《Frontiers in Microbiology》。

## 关键技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：（1）基于UNI CEN ISO/TS 6579–2:2012的微型化MPN方法，通过24孔板进行系列5倍稀释（6个稀释度，每稀释度4个重复），结合非选择性预增菌（缓冲蛋白胨水（BPW））和选择性增菌（改良半固体Rappaport-Vassiliadis培养基（MSRV））；（2）采用S. infantis特异性qPCR进行验证性确认，引物序列参考Yang等（2020），探针为FAM标记（5′-TCTTAGGTGAACGCAT-3′-BHQ1），扩增效率通过标准曲线评估；（3）Bland–Altman方法评估粪便基质对定量限（LOQ）的效应；（4）重复性和再现性评估遵循WOAH手册（章节1.16）标准；（5）样本来自意大利Forlì省13个肉鸡农场，每群动物年龄0-57天，使用粪便收集盒采样。

## 研究结果

### 检测限和定量限

根据ISO/TS 6579–2:2012，理论检测限（LOD）为8.9 CFU/g（0.95 log₁₀ CFU/g）。通过Bland–Altman分析，粪便基质引入约0.64 log₁₀的系统偏差（标准差0.40 log₁₀），但该偏差恒定且在置信限内，最终LOQ仍保持为8.9 CFU/g，表明方法在基质最大抑制效应下仍能定量。

### 分析特异性

29株S. infantis野外分离株和1株参考菌株（NCTC 6703/IZSLER 2150）均经qPCR呈阳性；60株其他沙门氏菌血清型及非沙门氏菌菌株（包括肠杆菌科）均无扩增，证明方法具有高特异性。

### 重复性和再现性

加标样本和自然污染样本的重复性实验中，变异系数（CV）均低于10%（见表1）。再现性实验中，除加标2 log₁₀水平CV为21.5%外，其余条件CV均低于10%，表明方法在不同操作者间具有稳健性。

### 方法适用性

对96份环境样本的分析显示，S. infantis载量从低于0.95 log₁₀ MPN/g到5.25 log₁₀ MPN/g不等。单因素方差分析（ANOVA）和Kruskal–Wallis检验均表明农场间差异显著（p<0.05），而农场内变异性也较大，如图1所示。例如，农场A在两个时间点（26天和40天）的中位浓度从4.14 log₁₀降至2.70 log₁₀ MPN/g。这些结果证实方法适用于评估不同农场环境中的S. infantis载量动态。

## 讨论与结论

讨论部分指出，意大利肉鸡中MDR S. infantis的农场到餐桌传播链已通过2011年克隆株的出现和2013-2014年人类感染得到证实（Franco等，2015）。近期研究（Russo等，2024）进一步在食品链多个采样点检测到携带bla_CTX-M-1的pESI-like质粒，耐药率高达97%。控制S. infantis需要多层面策略（如疫苗接种、垫料消毒、饲料添加剂等），但现有疫苗仅灭活三价疫苗（Nobilis? Salenvac ETC）在种鸡中应用。无论何种干预，降低环境载量是关键。MPN结合分子确认方法已在多种基质（水、食品、环境拭子）中成功应用，本研究扩展了其在禽类粪便中的适用性。初步观察显示，农场内和农场间的环境载量高度可变。该方法可检测从<10 MPN/g到>5 log₁₀ MPN/g的载量，适合用于评估感染动态、引入和持续性原因，以及结合屠宰场反馈数据评估防控措施效果。

**研究结论**：研究人员开发并验证了一种快速、特异的定量方法，用于禽类环境粪便中S. infantis的检测与定量。该方法通过小型化MPN步骤与S. infantis特异性qPCR确认结合，可有效应对粪便基质的复杂性，在加标和自然污染样本中均展现出良好的重复性和再现性。定量限符合ISO标准，且样本分析结果证实了该方法在评估农场间和环境内S. infantis载量变异性方面的适用性。该工具为QMRA框架下的风险管理和干预策略优化提供了可靠数据支持。