综述：动脉粥样硬化中的单细胞技术：揭示细胞异质性、作用机制与治疗机遇

《Current Atherosclerosis Reports》：Single-cell Technologies in Atherosclerosis: Uncovering Cellular Heterogeneity, Mechanisms, and Therapeutic Opportunities

　　

本综述旨在强调单细胞分析技术的最新进展及其在阐明动脉粥样硬化（atherosclerosis）细胞与分子复杂性方面的应用，重新定义对血管生物学及动脉粥样硬化斑块内免疫细胞功能的理解。单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）和空间转录组学已揭示人类及实验性动脉粥样硬化模型中免疫与血管细胞状态的前所未有的多样性。这些技术促成了新型巨噬细胞和平滑肌细胞（SMC）表型、独特内皮功能障碍特征以及寡克隆T细胞群体的发现。通过整合转录组学、表观基因组学、蛋白质组学和空间数据，研究人员阐明了疾病进展的关键机制，并鉴定出对靶向治疗有响应的细胞特异性分子通路。单细胞方法正通过确定斑块驻留细胞的异质性、可塑性和功能状态来改变对动脉粥样硬化的理解。这些洞见有助于开发新型生物标志物、精准诊断和靶向免疫调节策略，最终目标是改善动脉粥样硬化性心血管疾病的风险分层和个体化治疗。

本文系统综述了单细胞及空间组学技术在动脉粥样硬化研究中的应用进展，涵盖技术原理、细胞异质性解析、细胞间通讯网络及临床转化意义等方面。

动脉粥样硬化研究的新纪元

动脉粥样硬化以中、大动脉内脂质沉积和慢性炎症为特征，是全球心血管疾病发病和死亡的主要原因，主要通过导致心肌梗死、卒中和外周动脉疾病产生危害。传统上被视为脂质储存障碍的动脉粥样硬化，现已明确为一种慢性免疫介导的炎症性疾病，由血管细胞、免疫细胞和基质细胞之间的复杂相互作用驱动。近年来，分子与细胞生物学的进展显著深化了对动脉粥样硬化发病机制的理解。然而，人类动脉粥样硬化组织样本获取受限，制约了对单个细胞群体功能与生物学状态的全面认识，限制了对细胞异质性、稀有细胞类型以及斑块进展与消退过程中动态表型转变的充分表征。单细胞组学技术——特别是scRNA-seq、scATAC-seq和空间分辨率转录组学——的出现彻底改变了心血管研究，使得对病变组织内单个细胞进行无偏倚分析成为可能，为理解病理机制和治疗机遇提供了前所未有的洞见。

单细胞与空间技术的进展

单细胞转录组学与表观基因组学

scRNA-seq能够对数千个单个细胞进行高分辨率分析，以无偏倚和系统的方式揭示其基因表达程序。在动脉粥样硬化研究中，scRNA-seq已发现先前未知的巨噬细胞、SMC、内皮细胞（EC）和T细胞亚型，这些亚型在炎症、脂质代谢和基质重塑中可能具有不同作用，挑战了传统分类方式，揭示了此前未料到的细胞异质性程度和动态细胞相互作用。此外，scATAC-seq通过分析染色质可及性，提供关于调控元件、增强子-启动子相互作用及转录因子活性的信息。将其应用于动脉粥样硬化组织，已确认谱系重编程的关键表观遗传调控因子，如调控SMC可塑性和巨噬细胞激活的KLF4和TCF21。将scATAC-seq与scRNA-seq整合，可深入理解染色质可及性在基因调控及病理转变中的作用。

多重蛋白检测与多模态分析

Imaging Mass Cytometry（IMC）、CODEX和Phenocycler等多重成像平台允许同时检测数十种蛋白标志物，增强免疫表型分析并验证转录数据。新兴单细胞多组学技术可同时整合转录组、基因组、表观基因组、表观转录组、蛋白质组和代谢组等多种分子模态，弥合转录组学与蛋白质组学数据之间的差距，提高细胞状态分辨率，促进对免疫细胞和血管细胞群体的更好功能注释。REAP-seq和ECCITE-seq等技术允许在单细胞中同时测量蛋白质和mRNA，还可获得克隆型信息（如T细胞受体TCR/B细胞受体BCR序列）、扰动信息（如CRISPR筛选）或蛋白分泌数据，将单细胞分析从观察性研究拓展至机制性研究。

空间组学

解离性单细胞技术的关键局限在于空间信息的丢失。空间转录组学通过保留组织架构同时实现高分辨率基因表达分析，克服了上述缺点，提供更整合的细胞异质性、细胞间相互作用和组织架构视角。空间转录组技术可分为基于测序和基于探针两类：基于测序的平台（如Visium、Stereo seq、Aviti）可实现全转录组分析，但常缺乏单细胞或亚细胞分辨率；基于探针的平台（如Xenium、CosMx SMI、MERSCOPE）提供亚细胞分辨率，特别适用于解析组织微环境中细胞状态和组织结构的空间排布。应用于动脉粥样硬化斑块和血管周围区域时，这些高分辨率工具可详细表征细胞异质性（如富含巨噬细胞的坏死核心或经历内皮-间充质转化EndMT的内皮细胞簇）的空间分布、旁分泌信号参与、稀有或新型细胞状态的鉴定，以及受体-配体相互作用的空间定位。空间蛋白质组学作为补充，通过膜标志物和核标志物实现准确的单细胞边界界定，在免疫细胞和基质群体的鉴定分类中具有更高稳健性。

未来空间分析方向

单张切片空间多组学可在同一组织切片中同时分析RNA和蛋白表达，保留空间背景的同时整合分子模态。该方法利用蛋白标志物的稳定性和特异性进行准确细胞分割，再基于转录组数据揭示各群体内部的转录异质性和功能状态。在动脉粥样硬化背景下，这一策略可识别不同的免疫和基质亚群，重建细胞间通讯网络，是解析复杂组织微环境细胞结构和信号景观的关键工具。

再论动脉粥样硬化中的细胞角色

单细胞分析揭示的动脉粥样硬化斑块主要细胞类型相对比例显示，巨噬细胞和平滑肌细胞为优势群体。巨噬细胞在炎症、脂质摄取、泡沫细胞形成、胞葬作用中扮演核心角色；平滑肌细胞是斑块结构和稳定性的关键贡献者，并可发生转分化；T细胞代表病变内的适应性免疫反应；成纤维细胞和内皮细胞分别参与细胞外基质重塑和血管完整性维持及白细胞招募。

巨噬细胞：炎症状态的频谱

巨噬细胞是高度适应性的免疫细胞，能够动态响应多样化环境信号，在维持局部稳态、协调免疫应答、促进组织修复中发挥重要作用，在特定条件下也参与疾病病理发生。在动脉粥样硬化中，巨噬细胞是致动脉粥样硬化的核心，参与脂质摄取、炎症、胞葬作用和动脉重塑。单细胞分析推翻了传统的M1/M2二元分类，揭示了转录上不同的巨噬细胞亚群连续体：包括表达IL1β和NLRP3的促炎巨噬细胞、以TREM2和CD9为标志的脂质负载泡沫细胞、以及高表达MRC1和ARG1等抗炎基因的修复性巨噬细胞。TREM2⁺泡沫细胞巨噬细胞是人和小鼠动脉粥样硬化斑块中保守的、与疾病相关的细胞群体，参与脂质处理和吞噬作用。其他亚群专精于抗原呈递（表达MHC-II基因）、铁处理（SPIC⁺）或细胞外基质降解（MMP9⁺），其相对丰度和功能活性与动脉粥样硬化疾病阶段和临床结局相关。

T细胞：扩增的克隆型与功能多样性

T淋巴细胞浸润斑块并通过细胞因子分泌和细胞间相互作用调节炎症。单细胞分析结合TCR测序证实了CD8⁺和CD4⁺T细胞的寡克隆扩增，提示动脉壁内存在慢性抗原驱动的炎症反应。这些T细胞表达耗竭标志物（PD-1、LAG3）和细胞毒性标志物（GZMB、PRF1），部分表现为组织驻留特征。表达FOXP3的调节性T细胞（Tregs）发挥关键抗炎作用，但在高风险斑块中常功能受损或数量减少。Th1和Th17亚群分别产生IFN-γ和IL-17，驱动促炎通路并与斑块不稳定性相关。空间分析表明T细胞优先定位于巨噬细胞附近，提示直接的免疫调节串扰。

内皮细胞：从静止到间充质转化

内皮细胞构成血管腔面，是血管稳态的"守门人"。在动脉粥样硬化中，内皮细胞应对血流紊乱、氧化应激和炎症发生结构和功能改变。近期研究通过单细胞图谱详细描述了内皮细胞亚型，其黏附分子（VCAM1、ICAM1）、血管生成介质（ANGPT2、VEGFA）以及内皮-间充质转化（EndMT）标志物（SNAI1、ZEB2、ACTA2）表达存在差异。重要的是，EndMT正被确认为斑块纤维化和钙化的促进因素，代表内皮细胞向间充质样细胞的病理转分化，伴随屏障功能降低和基质产生增加。靶向EndMT可能为恢复内皮功能提供治疗途径。

平滑肌细胞：表型调制与可塑性

平滑肌细胞在动脉粥样硬化中表现出相当的表型可塑性。谱系示踪研究表明，中膜平滑肌细胞可丢失收缩标志物（如MYH11、ACTA2），并获得巨噬细胞样、成骨样或成纤维细胞样身份。这些转变受KLF4、OCT4和TCF21等转录调控因子监督，根据背景可产生保护性或有害性后果。成纤维肌细胞样平滑肌细胞有助于纤维帽形成和斑块稳定性，而巨噬细胞样平滑肌细胞可能加剧炎症和脂质滞留。

外膜与血管周围脂肪组织

外膜和血管周围脂肪组织（PVAT）正逐渐被认识为免疫活性腔室。这些区域的单细胞分析鉴定出驻留树突状细胞、成纤维细胞亚群和分泌细胞因子影响血管炎症的固有淋巴样细胞。外膜成纤维细胞可作为肌成纤维细胞或平滑肌细胞样细胞的祖细胞，参与血管重塑。PVAT根据其表型（棕色样vs白色样），可通过脂肪因子分泌产生抗炎或促炎效应，影响全身代谢和局部炎症。

细胞间通讯与调控网络

斑块内细胞的动态功能由复杂的细胞间通讯协调。CellPhoneDB、NicheNet和CellChat等计算工具分析单细胞数据以推断细胞类型间的配体-受体相互作用，证实了CCL2-CCR2、TNF-TNFRSF1A和CD40-CD40LG等参与白细胞招募、激活和存留的重要细胞通讯。巨噬细胞-T细胞串扰调节效应反应和免疫检查点表达，内皮细胞和平滑肌细胞通过Notch和TGF-β信号相互作用，促进表型转变和纤维化重塑。

转化意义与临床相关性

在风险和疾病活动度生物标志物方面，单细胞特征正被研究作为诊断和预后生物标志物。例如，检测具有类似炎性斑块巨噬细胞转录谱的循环单核细胞可反映活动性疾病；血浆来源的细胞外囊泡或细胞游离RNA携带单细胞信息标志物，可作为微创生物标志物。将这些分子标志物与超超高分辨率计算机断层扫描等先进无创影像技术结合，可能显著改善冠状动脉粥样硬化斑块的早期检测和监测。

靶向和免疫调节治疗

单细胞分析揭示的细胞特异性靶点为精准治疗提供了基础，包括靶向促炎巨噬细胞通路（如IL-1β、NLRP3）、平滑肌细胞转变调控因子（KLF4）或T细胞检查点（PD-1、CTLA-4）的单克隆抗体或小分子，以及CD47、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和活性氧等固有危险信号。扩增调节性T细胞群或促进修复性巨噬细胞表型的策略正在研究中。将高分辨率冠脉影像（如光学相干断层成像、光子计数冠脉CT血管造影）与单细胞洞见相结合，可实现对易损斑块的更好表征；基于空间组学发现的免疫细胞浸润或分子标志物成像，可改善精准风险分层和治疗决策。

挑战与未来方向

尽管取得变革性进展，仍面临诸多挑战：单细胞实验方案、质量控制流程和分析工作流的标准化对确保可重复性和最小化批次效应至关重要；实验数据与临床疗效之间的转化需要大规模前瞻性队列验证；疾病进展或治疗响应期间的纵向时间序列单细胞分析对识别动脉粥样硬化致病机制不可或缺；体内单细胞成像转录组学的进展将促进向介入心脏病学的转化；广泛的临床接受需要经济高效的平台和简化的常规诊断流程。单细胞和空间组学的进展开启了心血管研究的新时代，通过揭示动脉粥样硬化病变的复杂细胞景观，为疾病机制、细胞可塑性和细胞间通讯提供了无与伦比的洞见。多组学、空间和影像数据的整合正在为个体化、精准的心血管医学奠定基础。