MultNAT HPV16/18检测试剂：一种适用于即时检测（POCT）的简便、快速且低成本的聚合酶链式反应方法，用于检测HPV16和HPV18

《Cancer Nexus》：MultNAT HPV16/18 Assay: A Simple, Rapid, and Low-Cost Polymerase Chain Reaction Method for the Detection of HPV16 and HPV18 Suitable for Point-of-Care Testing

　　

目的：持续性高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染可导致癌前病变的发生，并可能进一步进展为浸润性癌。HPV状态不仅可作为鳞状细胞癌（HNSCC），如口咽鳞状细胞癌（OPSCC）的预后标志物，还会显著影响临床管理与治疗决策。尤其在资源受限地区，检测高危型HPV感染对于有效干预和癌症预防至关重要。本研究旨在考察一种基于TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术的即时检测方法，用于临床标本中HPV16和HPV18的快速检测。

方法：研究人员采用模拟宫颈拭子和唾液基质样本，评估MultNAT HPV16/18检测试剂的灵敏度和特异度。2023年1月至2025年12月，研究人员纳入萧山医院368例住院患者的临床宫颈拭子标本，其中包括268例宫颈癌相关病例和100例良性/非癌病例。为证明该检测方法同样适用于口咽鳞状细胞癌（OPSCC）患者唾液样本中的HPV检测，研究人员对235份由公司内部员工自行采集的唾液样本进行了检测。本研究采用MultNAT方法和常规荧光定量PCR技术，对包括宫颈拭子和唾液标本在内的临床样本中的HPV存在情况进行了评估。

结果：MultNAT HPV16/18检测试剂的检出限（LOD）为100 copies/mL，而对另外32种可导致口咽癌（OPC）或定植于上呼吸道的常见病原体的检测结果显示不存在交叉反应。在368份宫颈拭子标本中，MultNAT HPV16/18检测试剂在224份标本中给出阳性结果，其中HPV16阳性218例，HPV18阳性6例。与常规荧光定量PCR相比，MultNAT HPV16/18检测试剂的阳性符合率和阴性符合率分别为100.00%和98.60%。在368份宫颈拭子标本中，有2份标本经常规荧光定量PCR判定为阴性，但经MultNAT HPV16/18检测试剂检测为阳性。对这2份样本重新提取后，经常规荧光定量PCR复核证实为阳性。在235份唾液样本中，有1份样本经MultNAT HPV16/18检测试剂和常规荧光定量PCR均检测为HPV16阳性，Sanger测序证实了该结果。

结论：MultNAT HPV16/18检测试剂由于具有操作简便、周转时间短以及高灵敏度和高特异度，适合作为高危型HPV（HR-HPV）诊断的初始检测方法。

该文发表于《Cancer Nexus》，围绕一种面向即时检测（POCT）的高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）快速检测技术展开，核心目标是建立一种可在资源受限环境中应用、兼具高灵敏度、高特异度、低成本与操作简便性的HPV16/18核酸检测方法。研究背景在于，持续性HR-HPV感染与多种恶性肿瘤密切相关，尤其是宫颈癌以及头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中的一部分亚型。近年来，口咽鳞状细胞癌（OPSCC）中由HPV驱动的病例比例不断上升，HPV状态已不仅是病因学指标，也成为预后分层和治疗决策的重要依据。与HPV阴性患者相比，HPV阳性患者通常预后更好，因此临床上逐渐提出“降阶治疗”策略，即在保证疗效前提下降低治疗强度，以减少并发症和长期毒性。然而，这一策略实施的前提是对HPV状态进行准确、快速且可靠的判定。

目前，临床上用于判定HPV相关性的常见方法包括p16^INK4a免疫组织化学（IHC）和HPV-DNA检测。尽管p16^INK4a过表达具有较高敏感性，但其对高危型HPV感染并不完全特异，部分病例可出现p16阳性而HPV核酸阴性的情况。因此，单独依赖p16^INK4a检测存在误判风险。现行较为可靠的方案通常需要病理学和分子检测联合判读，但这一流程资源消耗大、耗时长，且结果往往不能快速反馈，不利于尽早制定治疗方案。在这一背景下，开发一体化、自动化、快速化的HPV核酸检测平台，成为推动精准诊断和个体化治疗的重要方向。

研究人员围绕MultNAT HPV16/18检测试剂开展研究。该方法基于TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR），针对HPV病毒基因组E6/E7区域进行扩增检测。E6/E7是高危型HPV致癌过程中最关键的功能区之一，其编码的癌蛋白可干扰宿主细胞周期调控，因此也是识别HPV相关肿瘤的重要分子标志。该检测系统采用预装式单管卡匣，将核酸裂解、提取、纯化、洗脱和扩增集成于同一反应体系中，在有电源供应条件下即可自动完成整个流程。研究首先验证其在宫颈拭子样本中的检测性能，随后进一步评估其在唾液样本中的适用性，以探索其用于HPV相关OPSCC筛查或辅助检测的潜力。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员以模拟宫颈拭子和模拟唾液基质样本评估检出限（LOD）和分析特异度；以萧山医院2023年1月至2025年12月收集的368例宫颈相关住院患者宫颈拭子样本作为临床验证队列，并纳入Ustar Biotechnologies Ltd.员工自采的235份唾液样本进行可行性验证；以常规荧光定量PCR作为对照方法，对不一致结果进一步采用Sanger测序及NCBI Blast分析复核；统计阳性符合率、阴性符合率及总符合率，以评价该方法的临床检测性能。

在研究结果部分，论文按照不同小节系统展示了该方法的分析性能与临床表现。

3.1 Analytical Sensitivity and Specificity
该部分主要通过模拟样本系列稀释实验评价MultNAT HPV16/18检测试剂的分析灵敏度，并通过多种非目标病原体验证其分析特异度。结果显示，该方法对HPV16和HPV18在模拟宫颈拭子和模拟唾液样本中的检出限均为100 copies/mL。在100、500、1000和5000 cps/mL浓度下，HPV16和HPV18均可实现20/20检出；在50 cps/mL时，检出率下降，提示100 copies/mL是稳定可靠的最低检出水平。特异度分析方面，研究人员检测了32种非目标病原体，包括其他高危型HPV、低危型HPV、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、SARS-CoV-2以及多种常见细菌病原体，结果均未出现阳性扩增，表明该方法不存在可见交叉反应，具有较高分析特异度。这一结果说明，MultNAT系统对HPV16/18靶标具有明确的识别能力，能够在复杂样本背景中保持较好检测准确性。

3.2 Clinical Performance
该部分通过真实临床样本比较MultNAT HPV16/18检测试剂与常规荧光定量PCR的检测一致性，并评估其在宫颈拭子和唾液样本中的应用价值。在368份宫颈拭子样本中，MultNAT方法检出224份阳性，其中HPV16阳性218例、HPV18阳性6例；对照PCR检出222份阳性，其中HPV16阳性217例、HPV18阳性5例。初始存在2份结果不一致样本，即MultNAT阳性而对照PCR阴性。研究人员对这2份样本重新提取核酸并复核后，最终常规荧光定量PCR也证实其为阳性，其中1例HPV16 Ct值为38.45，另1例HPV18 Ct值为37.86，提示二者均属于弱阳性样本。基于初始比较结果，MultNAT相对于对照PCR的阳性符合率为100.00%，阴性符合率为98.60%，总符合率为99.46%。若与临床诊断结果相比，其临床诊断敏感度为83.58%，特异度为97.00%，总符合率为87.23%。这一结果提示，该方法在宫颈拭子样本中与标准核酸检测技术具有高度一致性，且对低病毒载量样本可能具有较强检出能力。

在唾液样本验证中，研究人员共检测235份样本。结果显示，仅1份样本同时被MultNAT HPV16/18检测试剂和常规荧光定量PCR判定为HPV16阳性，且经Sanger测序证实。其余234份均为阴性。该组样本中，MultNAT相对于对照PCR的阳性符合率、阴性符合率及总符合率均为100.00%。虽然该部分样本并非来源于OPSCC患者队列，而是来自公司员工自采样本，因此更适合用于“适用性验证”而非疾病诊断效能评估，但结果至少表明该平台在唾液基质中具有可操作性，并具备检测HPV16的能力。结合口咽癌临床需求，这为后续开展基于非侵入性唾液样本的HPV相关OPSCC检测研究提供了技术依据。

论文讨论部分重点围绕HPV检测在临床管理中的意义、现有方法局限，以及MultNAT平台的优势展开。研究人员指出，HPV阳性OPC患者在个体化治疗中往往具有更优结局，因此准确判断HPV状态对于指导治疗策略十分关键。现有以p16^INK4a IHC为基础的诊断方法存在特异性不足的问题，部分病例中p16结果与HPV-DNA PCR或DNA原位杂交（DNA-ISH）并不一致，因此专业学会已建议在必要时进行补充性HPV特异检测。虽然也已有联合HPV RNA-ISH与p16 IHC的技术方案，但其操作复杂、耗时且依赖专业判读，限制了推广应用。相较之下，MultNAT HPV16/18检测试剂作为一步法诊断系统，能够在单一集成卡匣内完成DNA提取、扩增和检测，兼具自动化、低污染风险和操作简化等优势。研究结果表明，其对宫颈拭子和唾液样本分别达到99.46%和100.00%的总体一致性，从而支持其作为一种实用的核酸检测替代方案。

讨论中还强调，该方法不仅在技术上整合性强，而且在应用层面更接近临床即时检测场景。其单次检测仅需50 μL样本，整体流程约49 min完成，无需额外复杂设备，也不要求高水平分子生物学操作经验，因此特别适合基层医疗机构或资源匮乏地区。研究人员认为，该方法针对E6/E7靶区的检测策略可作为高危型HPV感染识别的潜在替代路径，从而弥补单纯p16-IHC检测的不足。与此同时，平台具有较好的扩展潜力，未来可通过开发更多特异性引物和探针，扩大到多基因型HPV同步检测，进一步提升综合筛查能力。

研究结论部分可译为：总之，研究人员开发了一种用于检测高危型HPV16和HPV18的快速且高灵敏度方法。该HPV检测方法相较其他方法具有若干优势。首先，其内在的一体化可行性使HPV分析更加实用，而这是传统方法中较难实现的；集成式卡匣提高了DNA片段分离效率，并降低了交叉污染风险。其次，自动化分析显著简化了多步骤样本处理流程并缩短了操作时间。最后，该方法显著减少了试剂消耗，并实现了高通量、高灵敏度、高特异度和高重复性分析。研究人员认为，该方法的建立将有助于HPV相关癌症筛查，并在生命科学、临床检测和现场肿瘤监测中展现出良好应用前景。将核酸提取、纯化和扩增过程集成到单一平台，进一步增强了平台的便携性和易用性。所开发的MultNAT平台为基于DNA的诊断提供了一种实用、高灵敏度且可降低污染风险的替代方案。其集成化、自动化操作以及经临床验证的性能，使其成为未来即时检测（POCT）应用，尤其是资源匮乏地区应用的理想候选平台。此外，鉴于MultNAT平台的较强能力，未来研究与开发将致力于扩展系统功能，使其能够在单一设备中检测多种HPV基因型，从而进一步拓宽系统的诊断能力，实现更全面的HPV筛查。