《Molecular & Cellular Proteomics》：Optimizing NGN2 Dosage Enhances the Neuronal Enrichment of iPSC-derived Neuronal Cultures
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对高度神经元富集的iPSC（诱导多能干细胞）衍生培养物进行蛋白质组学分析，可通过最小化非神经元群体的混杂信号，为神经系统疾病的发病机制提供宝贵见解。然而，在AAVS1位点稳定整合NGN2的单细胞iPSC克隆表现出mCherry报告基因的自发沉默。此外，NGN2
对高度神经元富集的iPSC（诱导多能干细胞）衍生培养物进行蛋白质组学分析，可通过最小化非神经元群体的混杂信号，为神经系统疾病的发病机制提供宝贵见解。然而，在AAVS1位点稳定整合NGN2的单细胞iPSC克隆表现出mCherry报告基因的自发沉默。此外，NGN2诱导后，培养物中常含有增殖性祖细胞，损害神经元的物理完整性。在此，研究人员表明EF1-α启动子的DNA甲基化增加与mCherry沉默相关。重要的是，报告基因沉默不影响iNeuron（诱导神经元）的衍生，有两条证据支持：第一，单细胞蛋白质组学分析表明mCherry沉默不会驱动未分化iPSC中可检测的蛋白质组学差异；第二， bulk蛋白质组学和免疫荧光分析表明，无论表达或缺失mCherry，iPSC衍生神经元培养物均类似于皮层谷氨酸能神经元。相反，iNeuron生成中的主要混杂因素是次优的神经元转化，导致培养过程中出现由活跃增殖的祖细胞和星形胶质细胞组成的细胞聚集体。研究人员发现四天的NGN2诱导期可显著增强神经元成熟和神经元特异性标志物的表达。此外，Notch信号通路的瞬时抑制与祖细胞减少一致。最后，观察到单等位基因NGN2整合而非双等位基因整合，优先增加CNS神经元标志物GPM6A的表达，而非外周神经标志物（PRPH、POU4F1、ILS1）。
人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）衍生神经元已成为模拟人类神经系统疾病（包括阿尔茨海默病（Alz海默's disease, AD））的宝贵来源。iPSC可由成体体细胞重编程获得，能够生成患者特异性神经元模型以重现疾病病理特征，从而为机制研究和药物发现提供新途径。特别是，iPSC向神经元的生成可通过多种方法实现，包括转录因子的强制表达，后者可将iPSC定向分化为多种神经元类型，包括谷氨酸能神经元。与定向神经元诱导相比，该方法具有效率高、可重复性好以及生成神经元细胞身份均一等优点。
转录因子Neurogenin-2（NGN2）的强制表达已成为诱导分化为具有皮层兴奋性特征神经元细胞的广泛采用方法。通过添加增强神经外胚层分化的小分子可进一步优化该方案，从而获得长期神经元培养物。然而，由于iPSC细胞系间的遗传变异以及实验方案的差异，该方法效率的优化仍面临挑战。值得注意的是，NGN2诱导持续时间对促进神经元分化的影响可导致所得细胞群体出现异质性。例如，神经元培养物常含有不同比例的祖细胞，这可能掩盖组学分析中成熟神经元特有的分子变化。这一混杂因素引发了对研究结果实验室内部及实验室间可重复性的担忧，特别是在模拟复杂神经系统疾病时，神经元特性的细微差异可能有助于更好地理解疾病表型并加速新发现。
在本研究中，研究人员利用特征明确的野生型iPSC细胞系KOLF2.1J，该细胞系是研究界可获得的资源，以在多次基因组编辑中保持基因组完整性而著称。研究人员采用转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）介导的基因组编辑，将三个表达盒稳定整合至KOLF2.1J iPSC的AAVS1位点：多西环素（doxycycline）诱导型NGN2转基因（Tet-On系统）、组成型表达的mCherry荧光报告基因以及用于筛选的嘌呤霉素抗性盒。在嘌呤霉素处理培养物的传代过程中，研究人员观察到基因组编辑单细胞克隆中mCherry表达发生自发沉默。mCherry阳性和阴性细胞的单细胞蛋白质组学分析揭示了编辑克隆内独立于mCherry表达的潜在分子异质性。此外，研究人员优化了KOLF2.1J衍生细胞系中现有的NGN2诱导方案。结果表明，虽然iPSC背景和mCherry沉默影响甚微，但NGN2诱导和Notch介导的信号传导是产生高度富集iPSC衍生神经元培养物的主要因素。
研究人员所依赖的关键技术方法包括：使用来源于白人英国男性供体的KOLF2.1J iPSC细胞系；通过TALEN介导的基因组编辑在AAVS1位点整合可诱导NGN2表达盒；荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离mCherry阳性与阴性细胞群体；靶标亚硫酸氢盐测序分析EF1-α启动子甲基化状态；单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, SCP）分析采用基于timsTOF质谱仪的DIA-PASEF数据采集模式；bulk蛋白质组学采用Orbitrap Astral质谱仪进行数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）；定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测Notch通路基因表达；免疫荧光染色验证细胞身份标记。
NGN2 iPSC细胞系的生成与mCherry沉默机制分析：研究人员采用TALEN介导的基因组编辑而非慢病毒递送，将多西环素诱导型NGN2转基因（Tet-On-NGN2）整合至KOLF2.1J iPSC的AAVS1位点，同时插入mCherry报告基因和嘌呤霉素抗性基因序列。经转染和mCherry阳性细胞手动富集后，单细胞克隆 unexpectedly 出现mCherry荧光丧失现象。通过FACS分离获得四种KOLF2.1J衍生细胞系：Clone 1、Clone 1-negativeagers25;negative、Clone 2和Clone 2-negative。PCR基因分型证实NGN2整合入AAVS1位点，但A2/A3引物对亦可检测随机整合，故建议使用针对PPP1R12C外显子1和供体载体序列的替代引物组合以提高特异性。流式细胞术显示Clone 1中仅11.4%、Clone 2中仅7.2%细胞保留mCherry表达。靶标亚硫酸氢盐测序表明，mCherry阴性细胞系（Clone 1-negative和Clone 2-negative）的EF1-α启动子区域15个CpG位点呈现最高甲基化水平（0.811-0.957），而mCherry表达较高的Clone 5甲基化水平最低（0.227-0.383），证实EF1-α启动子甲基化是导致mCherry沉默的表观遗传机制。
单细胞蛋白质组学揭示mCherry沉默不影响iPSC分子身份：为评估EF1-α-mCherry沉默是否在未分化iPSC中引入分子异质性，研究人员对四种细胞系进行SCP分析。结果显示每细胞鉴定250-700个蛋白，峰值约450个。Leiden聚类识别三个细胞群体，但UMAP可视化显示细胞系、mCherry表达、蛋白鉴定数或细胞周期阶段与聚类结果不重叠，表明mCherry报告基因表达对编辑细胞的分子身份影响可忽略。三个聚类分别特征性表达：主要群体（Cluster 1）富集微管蛋白、组蛋白、核RNA结合蛋白及核糖体40S亚基组分；核糖体蛋白群体（Cluster 2）富集60S和40S核糖体亚基蛋白及RNA加工相关分子；上皮样细胞群体（Cluster 3，仅占4.3%）表达角蛋白等上皮标志物，可能代表自发分化细胞或MS污染物。
NGN2诱导方案优化与神经元分化效率比较：研究人员比较了两种NGN2驱动分化方案。Protocol 1采用72小时多西环素诱导，Protocol 2延长至96小时（额外24小时多西环素脉冲）。Protocol 1衍生的28 DIV培养物出现细胞聚集和活跃增殖迹象，Nestin阳性细胞形成聚集体，提示神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）存在和亚优转化效率。Protocol 2的NeuN阳性细胞比例≥95%，Nestin阳性细胞niches显著减小，表明延长NGN2诱导减少NPCs比例。
Bulk蛋白质组学证实Protocol 2增强神经元分化：PCA显示Protocol 2样本聚类更紧密，且mCherry阴性细胞系与其阳性对应物聚类在一起，提示mCherry沉默不影响分化轨迹。Protocol 1（Cluster 1）中NES、SOX2和MKI67等NPC与增殖标志物z-score中位数升高，而Protocol 2（Cluster 2）中神经元和突触标志物（TUBB3、SYN1、Synaptophysin）及谷氨酸能标志物VGLUT2表达更高、分布更集中。值得注意的是，GFAP、CD44和ALDH1L1等星形胶质细胞标志物在Cluster 1中显著富集，提示Protocol 1更易向胶质谱系分化。
免疫荧光验证Protocol 2的神经元成熟改善：Protocol 1的28 DIV培养物中Nestin阳性聚集体较15 DIV更大，周边缺乏NeuN阳性细胞，提示2D培养物结构完整性受损。Protocol 2则显示更均一的NeuN阳性细胞分布，并表达Synapsin-1、TUJ1、MAP2等神经元成熟和突触形成标志物。NeuN阳性细胞共表达CUX1和VGLUT1，证实皮层兴奋性神经元身份。残留Nestin阳性细胞不表达CUX1，提示有限但持续的NPCs存在。
差异蛋白质组学与信号通路分析：差异表达分析显示显著调控蛋白与NPCs、皮层谷氨酸能神经元及星形胶质细胞的谱系特异性标志物相关。GO富集分析揭示神经发育、神经元分化、胶质生成和星形胶质细胞分化通路显著过表达，其中星形胶质细胞分化相关蛋白（GO:0048708）在Protocol 1中水平更高。研究人员提出NPCs向星形胶质细胞分化的模型，涉及Notch和JAK-STAT信号通路激活。Protocol 2联合DAPT（Notch信号抑制剂）处理可消除细胞聚集，与Notch通路抑制促进神经元分化的机制一致。
DAPT抑制Notch通路减少祖细胞：qRT-PCR验证DAPT处理显著抑制Notch通路活性。在NGN2纯合（Clone 2）和杂合（Clone 5）整合细胞系中，DAPT均显著降低NOTCH1和HES5表达，减少NOTCH1、DLL1等祖细胞相关分子程序；杂合系中NGN2表达轻微增加，提示降低Notch信号增强神经发生基因表达。
NGN2诱导时程对神经元成熟与身份的影响：在Clone 2（NGN2纯合）和Clone 5（NGN2杂合）中进行3、4、8或15天诱导时程分析，所有培养物均维持至28 DIV。线性模型显示基因型（细胞系）和诱导时长对蛋白质组影响最大，DAPT效应有限。Pearson相关分析显示杂合Clone 5在有无DAPT时差异大于纯合Clone 2。神经元成熟评分（基于25基因参考集，检测到20个）显示Day 4为参照点时评分最高，Day 3、8和15天（Clone 2）或仅Day 15（Clone 5）显著降低。神经元特异性标志物评分（49基因参考集，检测到36个）同样显示Day 4最优。祖细胞评分（VIM、PCNA、NES）在Day 3最高，Day 4最低。有趣的是，NGN2双等位基因整合的Clone 2表现出更高外周神经元标志物（PRPH、POU4F1、ILS1），而NGN2单等位基因整合的Clone 5显示更高CNS相关标志物GPM6A表达。
讨论部分总结：NGN2驱动分化方案可高效产生具有皮层兴奋性特征的神经元，但实现持续高效分化和规模化生产仍存挑战。本研究建立的KOLF2.1J iPSC平台实现了多西环素诱导型NGN2表达盒在AAVS1位点的稳定整合。综合单细胞和bulk蛋白质组学及免疫荧光成像，研究人员评估了mCherry报告基因沉默在未分化iPSC中的功能影响，并系统比较两种NGN2驱动分化策略的神经元生成能力。靶标亚硫酸氢盐测序揭示mCherry沉默克隆中EF1-α启动子CpG甲基化增加，表明启动子甲基化是 reporter 沉默的可能机制但不影响神经元身份。
SCP分析虽尚未 benchmarking 用于神经元细胞类型鉴定，但本研究证明了其作为分化前评估分子均质性的正交质量控制方法的实用性。KOLF2.1J衍生系中检测到关键多能性相关蛋白（PTMA、HSP90AB1、HSPA8）的稳健表达，免疫染色证实OCT4表达，支持NGN2靶向整合不破坏维持多能状态的关键调控网络。尽管NGN2和mCherry转基因成功整合，EF1-α启动子下mCherry表达发生自发沉默，但细胞保留CAG启动子驱动的四环素反式激活蛋白（rtTA3G）表达，缺乏mCherry表达的编辑iPSC系仍保留NGN2诱导神经元分化能力，表明mCherry沉默不损害Tet-On-NGN2系统功能。EF1-α启动子在AAVS1位点的脆弱性支持其弱于CAG启动子的结论。
centroid欧氏距离分析证实mCherry沉默对神经元分化影响可忽略。两实验方案间出现明显区分：Protocol 2（延长NGN2诱导）产生更多变的蛋白质组学特征，提示增强神经元成熟；Protocol 1（较短诱导）产生较不成熟表型。差异表达蛋白分析进一步支持这一区分：较短NGN2诱导形成Nestin阳性细胞聚集并随时间增大，表明活跃增殖和神经源性niche样结构；28 DIV培养物富集MIK67、SOX2、POU3F和NOTCH1/3等分子，POU3F与SOX2协同决定NES表达并促进胚胎干细胞神经元命运承诺，NOTCH受体激活通过下调NGN2和DLL1基础表达维持神经祖细胞状态抑制神经元分化。神经元或NPCs分泌的生长因子进一步影响命运决定，通过已知通路促进星形胶质细胞分化，导致混合培养物形成。较长NGN2基因剂量产生NPCs频率降低、星形胶质细胞标志物表达减少，同时增强CUX1、PSD95、VGLUT2、GRM2和SYN等皮层谷氨酸能身份相关神经元成熟标志物。Notch信号抑制剂DAPT有效减少NPCs聚集并维持神经元完整性，iPSC衍生培养物在Protocol 2加DAPT处理后缺乏细胞聚集。转录分析支持DAPT通过降低NOTCH1及其下游效应因子HES5表达增强神经元分化，该效应在纯合和杂合NGN2背景均存在，提示Notch抑制独立于NGN2基因剂量限制祖细胞相关程序。
研究结论：尽管mCherry报告基因自发沉默，NGN2驱动神经元分化仍保持稳健，且蛋白质组水平上reporter丢失未导致mCherry阳性与阴性iPSC的主要分离。时程蛋白质组学分析表明，延长NGN2诱导不增强神经元成熟反而降低关键神经元成熟标志物整体表达。此外，AAVS1位点NGN2双等位基因整合与外围神经元标志物出现相关，提示NGN2表达持续时间和剂量均是塑造神经元培养物身份的关键因素。这些发现凸显了表征NGN2剂量和优化诱导持续时间以最小化祖细胞污染、改善神经元单培养物获取的重要性。
