杆状病毒表面展示技术用于流感细胞因子谱分析、血清学检测及抗病毒筛选

《Microbial Biotechnology》：Applying Baculovirus Surface Display Technology for Influenza Cytokine Profiling, Serological Detection and Antiviral Screening

　　

流感每年导致约十亿例感染和数十万人死亡，偶尔还会出现高致病性新毒株。针对新型流感病毒或多病毒株的研究常因需要高生物安全等级（BSL）实验室而受到限制。为克服这一局限，研究人员尝试利用杆状病毒表面展示技术建立一种与BSL-1兼容的流感研究平台。研究人员构建了流感病毒假病毒HA-Bac和NA-Bac，通过在杆状病毒表面展示来自流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白实现。不同的HA-Bac和NA-Bac在转导呼吸道上皮细胞和巨噬细胞系后，诱导了独特的炎性细胞因子谱。利用感染这些HA-Bac和NA-Bac的昆虫细胞作为抗原，研究人员建立了基于细胞和裂解物的酶联免疫吸附试验（ELISA）以检测HA和NA抗体。基于裂解物的ELISA在检测患者血清样本中的IgG抗体方面表现出优异性能。最后，在功能抑制试验中，HA-Bac感染昆虫细胞诱导的血凝反应以及NA-Bac感染细胞产生的神经氨酸酶活性均被相应抗病毒药物抑制。总之，该研究建立了一个安全的流感研究系统，能够在BSL-1条件下进行细胞因子谱分析、血清学检测和抗病毒药物筛选。该系统有望应用于其他新兴呼吸道病毒并支持公共卫生 preparedness。

流感作为全球性 recurring 疾病，每年造成约十亿例感染，其中约300万至500万例为重症病例，29万至65万人死于呼吸道并发症，对公共卫生构成重大威胁。历史上已发生四次全球大流行，且新的病毒毒株持续出现。针对致病机制、检测方法和治疗手段的研究对于应对未来流感流行至关重要。然而，流感病毒研究，特别是针对新兴毒株的研究，通常需要在高生物安全等级（BSL）实验室中进行，这极大地限制了相关研究的广泛开展。此外，流感感染过程中炎性细胞因子的过度表达可导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）或慢性阻塞性肺疾病（COPD）等严重病理变化；而病毒抗原漂移频繁，使得新型抗病毒候选药物的持续探索及血清学检测方法的建立成为公共卫生 preparedness 的关键需求。在此背景下，研究人员致力于开发一种安全、灵活且多用途的替代研究平台。

研究人员利用杆状病毒表面展示技术，构建了展示季节性流感病毒HA和NA蛋白的重组杆状病毒HA-Bac和NA-Bac，涵盖甲型流感病毒（IAV）H1N1、H2N2、H3N2亚型及乙型流感病毒（IBV）的Victoria和Yamagata谱系共五种HA和四种NA变体。研究人员首先通过Western blot和免疫荧光共聚焦显微镜验证了重组蛋白的表达与膜定位；继而利用AlphaFold3结构预测及与蛋白质数据库（PDB）参考蛋白的比对分析，证实了重组蛋白保留天然样构象。在功能应用层面，研究人员将HA/NA假病毒转导至A549人肺上皮细胞系和PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞样细胞系，通过多重磁珠细胞因子检测技术分析了13种与ARDS、COPD和哮喘相关的炎性因子表达谱；采用感染昆虫细胞作为抗原材料，分别建立并优化了基于完整细胞和细胞裂解物的ELISA系统，用于检测患者血清中的HA/NA特异性抗体；同时构建了血凝抑制（HAI）试验和神经氨酸酶抑制（NI）试验平台，评估候选化合物的抗病毒活性。

研究结果方面，在"构建重组杆状病毒并确认HA和NA蛋白在昆虫细胞中的表达与表面展示"部分，研究人员采用三种表达载体设计：HA蛋白保留GP64跨膜结构域（TMD）和胞质尾结构域（CTD），NA蛋白保留其天然II型膜结构域，所有构建均携带tdTomato荧光报告基因以指示感染和蛋白表达。Western blot显示所有HA抗原分子量符合理论预期（约60-75 kDa），NA蛋白主要以多聚体形式存在；免疫荧光证实重组蛋白主要定位于细胞膜表面。

在"HA和NA蛋白在A549和THP-1细胞中诱导的细胞因子谱分析"部分，研究人员发现不同HA/NA亚型可触发不同的免疫应答：A549细胞中，多数HA-和NA-Bac显著上调IP-10、RANTES和TSLP，尤以H1-Bac、YN-Bac和VN-Bac为甚；THP-1来源巨噬细胞中则诱导MIP-1α、IFN-α、IL-1β、TNF-α和IL-17A等因子表达，揭示了同一抗原刺激下呼吸道上皮细胞与免疫细胞细胞因子应答的差异性。

在"利用表达HA和NA的昆虫细胞开发血清学检测方法"部分，研究人员比较了细胞型与裂解物型ELISA的信号强度与特异性。结果显示，两种系统均能检测抗原特异性抗体，但裂解物型ELISA在使用抗IBV-HA抗体时呈现出更优的谱系特异性，且信号更为均一；在检测患者血清时，裂解物型ELISA表现出更大的信号强度差异。

在"患者血清检测中血清学ELISA的实施与性能评价"部分，研究人员以商业核蛋白（NP）ELISA作为验证基准，将14份血清样本重新分类为NP阴性和NP阳性。裂解物型ELISA检测显示，NP阳性患者呈现更高的IgG信号，几乎所有NP阳性患者对至少一种HA抗原产生显著ELISA信号，且多数样本对H1和VH抗原反应最强；IgM检测则因样本采集时间过早（多为症状出现当日或2日内）而普遍呈低应答。

在"利用HA-和NA-Bac感染细胞开发抗病毒分子筛选系统"部分，血凝试验确认除YH-Bac外所有HA-Bac感染细胞均具有血凝活性；HAI试验显示strictinin、18β-甘草次酸、甘草甜素和姜黄素可抑制H1介导的血凝，其中姜黄素对H2和VH也有效，而eurycomanone和sesamin无抑制作用。NI试验中，所有四种NA均显示明确酶活性，oseltamivir呈剂量依赖性抑制，尤其对IAV来源的N1和N2抑制作用更为明显，而对IBV来源的NA特别是YN抑制较弱。

讨论部分，研究人员指出该平台的创新性在于将多种流感病毒HA和NA亚型整合至统一的生物安全平台，避免了获取多种活病毒或纯化多种膜锚定重组蛋白的困难，且可直接识别具有活性的HA和NA分子。研究人员特别说明，由于杆状病毒在哺乳动物细胞中不复制，实验中使用了较高感染复数（MOI=100）以确保可靠的细胞因子应答；该平台定位为 reductionist 平台，用于比较单个HA或NA分子相关的亚型依赖性免疫应答，而非完全模拟天然病毒感染。关于ELISA系统优化，研究人员强调使用感染细胞而非纯化病毒颗粒可显著减少抗原制备时间和材料消耗，裂解物型ELISA通过消除细胞固定步骤、允许更剧烈的洗涤流程，更适合多抗原同时处理。研究人员也限制了该平台的局限性：目前尚属 proof-of-concept 血清学平台而非最终定量诊断方法，绝对定量HA和NA水平的标准化参考方法有待未来验证；血清学评估基于小规模儿科队列（n=15）且多为急性期样本，需更大规模多阶段临床队列验证。此外，昆虫细胞与哺乳动物细胞在糖基化模式上存在差异，但基于既往和本研究结果，HA和NA的关键构象特征及功能活性在该表达系统中得到良好保留。对于YH-Bac无血凝活性的现象，研究人员推测可能与HA1受体结合域功能完整性、Yamagata谱系对SAα2,6糖链的偏好性以及火鸡红细胞表面糖链组成有关。

研究结论部分翻译如下：本研究建立了一个安全且灵活的基于杆状病毒的假病毒系统，能够在BSL-1条件下进行流感血清学检测、抗病毒药物筛选和细胞因子谱分析。多种HA和NA亚型的组合使得抗原特异性抗体和免疫应答的更全面分析以及药物响应性评估成为可能。该平台为流感研究提供了实用且适应性强的工具，并可扩展至其他新兴传染病，以增强公共卫生 preparedness。