躯体感觉腹侧基底(ventrobasal, VB)丘脑局灶性缺血性卒中产生持续性自发性疼痛样行为

《Neurobiology of Disease》：A focal ischemic stroke of the somatosensory thalamus produces persistent spontaneous pain–like behavior

　　

躯体感觉腹侧基底(VB)丘脑的缺血性损伤与中枢性卒中后疼痛(central post-stroke pain, CPSP)高度相关，但目前缺乏选择性局灶性缺血性VB损伤的临床前模型。本研究利用光血栓性闭塞(photothrombotic occlusion)建立了小鼠躯体感觉丘脑缺血性卒中模型。卒中小鼠在4周观察期内表现出持续性自发性面部痛苦表情(facial grimace)，符合持续性情感性行为状态。后爪机械觉减退(hyposensitivity)及姿势异常为短暂性，卒中早期出现并于两周内恢复。上述诱发及姿势指标与各时间点面部痛苦表情行为无相关性，表明持续性痛苦表情与短暂性感觉或运动表型相分离。免疫组织化学显示丘脑胶质细胞活化增强，腹后外侧核(ventroposterolateral nucleus, VPL)小胶质细胞增生(microgliosis)与4周时面部痛苦表情严重程度呈正相关。综上，本研究确立了一种可重复的局灶性缺血性躯体感觉丘脑卒中模型，其特征为持续性自发性面部痛苦表情行为伴分离的短暂性诱发及姿势改变，为探究缺血性丘脑损伤后CPSP相关机制提供了研究框架。

论文解读：躯体感觉腹侧基底(VB)丘脑局灶性缺血性卒中产生持续性自发性疼痛样行为

本文由Jeremy B. Ford、Olive Tambou Nzoutchoum、Jarret A. Weinrich、Debleena Chatterjee、Allan I. Basbaum及Jeanne T. Paz发表于《Neurobiology of Disease》。

研究背景与目的

每年全球新增卒中超1220万例，高达35%的幸存者发展为中枢性卒中后疼痛(central post-stroke pain, CPSP)，尤以腹侧基底(ventrobasal, VB)丘脑（含腹后外侧核ventroposterolateral nucleus, VPL及腹后内侧核ventroposteromedial nucleus, VPM）缺血性病变为常见病因。CPSP最具致残性的特征是持续性自发性疼痛(spontaneous ongoing pain)，但现有临床前CPSP模型多采用胶原酶诱导的出血性丘脑损伤，且多关注诱发性的机械性痛觉过敏(mechanical allodynia/hyperalgesia)，极少模拟占临床87%的缺血性卒中及最核心的自发性疼痛表型，存在显著的转化鸿沟。为此，研究人员建立光血栓(photothrombotic)诱导的小鼠局灶性VB丘脑缺血性卒中模型，旨在验证其能否再现CPSP的核心特征——持续性自发性疼痛样行为及其与短暂性感觉运动改变的分离现象，并探讨其与丘脑神经炎症的关联。

主要关键技术方法

研究人员选用成年C57BL/6雄性小鼠，分先导队列(n=25)优化光剂量及假手术(sham)对照组，主行为学及组织学队列(n=30，卒中组n=17，假手术组n=13)。采用立体定位将光纤置入右侧VPL/VPM区（前囟后?1.54 mm，中线旁+1.84 mm，皮质下3.0 mm），腹腔注射玫瑰红(Rose Bengal, RB, 40 mg/kg)后以532 nm激光(3 mW，120 J/mm2即21 min)照射诱导光血栓性局灶缺血；假手术组以等量生理盐水替代RB。纵向行为学检测包括：小鼠面部痛苦表情评分(Facial Grimace Scale, FGS)录像人工评分（眼、鼻、颊、耳、须5个动作单元各0–2分加和）、旷场实验(open field test, OFT)结合DeepLabCut无标记姿态估计量化运动期躯干长度（胸-腹标志点欧氏距离，反映驼背姿势）及活动度、von Frey纤维丝上行-下行法(Dixon up-down method)测定对侧后爪机械撤足阈值(mechanical withdrawal threshold)、加速转棒(rotarod)测试运动协调。灌注固定后行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色计算梗死体积，免疫荧光染激活小胶质细胞离子钙结合适配分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1, Iba1)及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)，借助ABBA(Aligning Big Brains & Atlases)配准Allen脑图谱分区定量，NeuN染色计数神经元丢失，侧脑室面积比评估结构性萎缩。数据采用重复测量双因素ANOVA及线性回归等统计分析。

研究结果

3.1. Optimizing a novel ischemic model of somatosensory thalamic stroke（新型躯体感觉丘脑缺血性模型的优化）

通过梯度光剂量(95、120、190 J/mm2)滴定发现，120 J/mm2可在VPL/VPM产生局限一致性梗死且无周围组织波及，假手术组无TTC阴性区，故选定此参数用于后续实验。

3.2. Ischemic somatosensory thalamic stroke produces persistent spontaneous facial grimace with dissociated transient postural and sensory alterations（缺血性躯体感觉丘脑卒中产生持续性自发性面部痛苦表情及分离的短暂姿势与感觉改变）

—3.2.1. Spontaneous pain-like behaviors: facial grimace and hunched posture（自发性疼痛样行为：面部痛苦表情与驼背姿势）：卒中组自术后4天至4周各时点FGS均显著高于假手术组(p<0.0008)，提示持续性自发性疼痛样情感状态；面颊膨出与鼻部变化贡献最大。躯干长度在术后4天显著缩短（约8.8%，驼背姿势，p=0.016），2周恢复至基线，呈短暂性。

—3.2.2. Evoked mechanical sensitivity（诱发机械敏感性）：术后4天卒中组后爪撤足阈值升高(35.5%增加，p=0.044)，表现为短暂性机械觉减退/迟钝(hyposensitivity)，多数个体(13/17)有此表现，1周恢复正常；未观察到持续性机械性痛觉过敏。

—3.2.3. Dissociation across spontaneous and evoked pain-like behaviors（自发性与诱发疼痛样行为的分离）：FGS与von Frey阈值变化、FGS与姿势改变、姿势与von Frey间均无显著线性相关(p=0.30、0.45、0.78)，证实三者属独立行为维度。

—3.2.4. Absence of gross motor deficits（无显著总体运动缺陷）：两组总移动距离、最大速度、旷场中心停留时间及转棒表现无差异，排除面部表情改变源于运动障碍。

3.3. Ischemic somatosensory thalamic stroke produces thalamic neuroinflammation（缺血性躯体感觉丘脑卒中引发丘脑神经炎症）

术后4周，卒中组丘脑同侧/对侧Iba1荧光强度比升高~25%(p=0.0009)，GFAP升高~35%(p=4.0×10??)；ABBA分区显示VPL、VPM及丘脑网状核(reticular thalamic nucleus, RT)小胶质细胞及星形胶质细胞活化显著。VPL和VPM区NeuN阳性神经元计数显著减少，证实神经元丢失。梗死核心区Iba1?小胶质细胞呈变形阿米巴样，周边为GFAP?星形胶质细胞构成的胶质瘢痕。

3.4. Stroke topology and VPL microgliosis are associated with the severity of pain-like behaviors（卒中拓扑位置及VPL小胶质细胞增生与疼痛样行为严重度相关）

更靠后(postero-caudal)的梗死与更高FGS相关(p=0.027)，更腹侧(dorso-ventral)梗死与更强早期机械觉减退相关(p=0.023)。卒中组内VPL区（非VPM）Iba1同侧/对侧比值与4周FGS呈显著正相关(p=0.01)；VPL受累>10%者FGS高于受累<10%者(p=0.033)。全脑总梗死体积与行为无相关。

3.5. Structural consequences of ischemic somatosensory thalamic stroke（缺血性躯体感觉丘脑卒中的结构性后果）

术后4周卒中组同侧侧脑室/对侧面积比显著增大(p=0.0079)，提示局部组织丢失继发脑室扩大。

讨论与结论总结

研究人员指出，该光血栓性局灶VB丘脑缺血模型具备构效效度（模拟临床87%缺血性病因及Dejerine-Roussy综合征解剖部位VPL/VPM）及表面效度（再现CPSP自发性持续疼痛伴短暂感觉减退、分离现象、VPL微胶质活化相关及梗死部位依赖的行为差异、同侧脑室扩大等临床特征），弥补了既往出血模型偏重诱发过敏而忽视自发痛的不足。局限性包括面部痛苦表情为疼痛样情感的间接指征、小胶质活化与行为的因果未验证、未测温度觉、未纳入雌性动物及仅限局灶小梗死。结论为：本研究建立了一种可重复的局灶缺血性躯体感觉丘脑卒中小鼠模型，其特征为CPSP核心表型——持续性自发性面部痛苦表情行为，且该表型独立于持续性诱发感觉异常，提示丘脑卒中后可分离的行为维度；此模型为解析缺血性丘脑损伤后持续性自发痛状态机制提供了可行框架。