ATS2021株类鼻疽伯克霍尔德菌等基因bimA突变株的特征分析

《Infection and Immunity》：Characterization of an isogenic bimA mutant in the ATS2021 strain of Burkholderia pseudomallei

　　

脑脊髓炎并不常见，但与类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）菌株相关，这些菌株的bimA基因（编码一种肌动蛋白运动蛋白）与鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia mallei）的bimA（命名为bimA_Bm）相似。研究人员先前对B. pseudomallei野生型ATS2021（bimA_Bm）的毒力进行了特征分析。在ATS2021气溶胶暴露的小鼠模型中，暴露后早期在脑中观察到病变和炎症细胞因子，并通过嗅神经到达中枢神经系统（CNS）。在本研究中，野生型ATS2021中的bimA等位基因被替换为bimA_Bp，并通过半数致死剂量（LD50）估计、组织病理学分析和细菌播散来评估毒力。ATS2021 bimA_Bp到达CNS，但显著减毒，表现为更高的LD50估计值、改变的细菌播散和减少的神经炎症。对气溶胶暴露小鼠的肺、脾和脑中的免疫反应分析表明，两种菌株诱导了共享和分化的免疫模式。最后，通过NanoString转录组平台分析对脑中的宿主反应进行评估表明，与突变型bimA_Bp细菌相比，野生型ATS2021诱导了星形胶质细胞和小胶质细胞活化、少突胶质细胞功能以及整体炎症信号传导的显著变化。这些结果支持bimA_Bm基因产物在吸入后细菌播散中的直接作用。

**研究背景与问题**
类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）是类鼻疽的病原体，在热带和亚热带地区高度流行，通过皮肤接种、摄入或吸入污染土壤或水感染人类和动物。类鼻疽临床表现多样，包括皮肤软组织感染、脾肝脓肿、肺炎、脑脊髓炎等，死亡率约10%–40%。目前尚无许可疫苗，抗菌治疗至少持续3–6个月。B. pseudomallei是兼性胞内病原体，通过肌动蛋白运动蛋白BimA（Burkholderia intracellular motility A）聚合肌动蛋白实现细胞内和细胞间运动，形成多核巨细胞（MNGC）。B. pseudomallei的bimA基因存在两种等位基因：bimA_Bm（与鼻疽伯克霍尔德菌相似）和bimA_Bp。流行病学研究表明，携带bimA_Bm等位基因的菌株与神经性类鼻疽（脑脊髓炎）高度相关，且死亡率更高。然而，由于B. pseudomallei具有开放基因组，不同菌株间存在大量独特基因，难以确定毒力差异是否完全由bimA_Bm等位基因引起。本研究旨在构建B. pseudomallei ATS2021菌株（源自2021年美国类鼻疽暴发，其bimA_Bm等位基因导致神经性疾病）的等基因bimA突变株，并系统评估bimA_Bm和bimA_Bp的致病性与毒力差异。论文发表在《Infection and Immunity》。

**主要关键技术方法**
研究人员构建了等基因突变株：用来自原型菌株K96243（bimA_Bp）的bimA等位基因替换野生型ATS2021（bimA_Bm）的内源bimA基因，通过基因置换载体pMo130和接合转移获得。体外实验使用RAW264.7（小鼠巨噬细胞样细胞）、C8-D1A（小鼠星形胶质细胞样细胞）和A549（人肺上皮细胞）细胞系，评估了肌动蛋白运动、MNGC形成、噬斑形成、胞内复制和生物膜形成。体内实验采用C57BL/6小鼠模型，通过全身气溶胶暴露系统感染，测定LD50、细菌负荷、组织病理学（H&E染色和免疫组化IHC）、细胞因子（Luminex多重免疫分析）和宿主脑转录组（NanoString nCounter神经炎症面板）。样本来源包括小鼠肺、脾、脑和血液。

**研究结果**
- **ATS2021携带bimA_Bp等位基因在RAW264.7细胞中聚合宿主肌动蛋白、生成膜突起，在A549细胞中形成噬斑，但胞内复制有差异**：通过共聚焦显微镜观察，野生型ATS2021和突变株ATS2021 bimA_Bp均能形成肌动蛋白尾和膜突起，并诱导MNGC形成。然而，在RAW264.7细胞中，感染后6、8、10小时，野生型ATS2021的胞内复制和存活显著高于突变株（负二项广义线性模型，P<0.01）。在C8-D1A星形胶质细胞中，野生型在8和10小时也显示更高的复制和存活。
- **ATS2021 bimA_Bp无生长缺陷，但生物膜产生缺陷**：在富培养基中，两菌株浮游生长无差异。但突变株在37°C静态培养24小时后生物膜显著减少（线性混合效应模型，P=0.033）。
- **ATS2021 bimA_Bp在C57BL/6小鼠中显著减毒**：通过气溶胶暴露，野生型ATS2021的21天和60天LD50分别为56.4 CFU和5.8 CFU，而突变株的LD50分别为564.1 CFU（95% CI: 271.5–1173.0）和104.5 CFU（95% CI: 46.5–246.5），差异显著（Probit模型，P=0.0016和0.0002）。在10、100、1000 CFU目标剂量组，突变株感染小鼠的生存率或生存时间均显著优于野生型。
- **细菌负荷降低**：在100和1000 CFU目标剂量组，突变株感染小鼠的肺和脑细菌负荷显著低于野生型（线性混合效应模型，肺第10天P=0.0025，脑第7天P=0.0005）。在1000 CFU组，脾、肺、脑的细菌清除更快。
- **组织病理学和免疫组化差异**：野生型ATS2021感染小鼠在肺、肝、脾、鼻甲、嗅神经、嗅球和椎体骨髓出现早期和更严重的病变，包括化脓性炎症、坏死和出血，而突变株感染小鼠的病变程度和范围显著减轻，尤其是脑和脊髓。总组织学严重度评分野生型（100 CFU: 231; 1000 CFU: 474）远高于突变株（83; 260）。IHC显示野生型菌株的Burkholderia染色阳性区域更大（总分112和204 vs 15和151）。
- **细胞因子反应差异**：在1000 CFU组肺匀浆中，野生型感染导致促炎细胞因子从第1天至第5天持续升高，而突变株感染后细胞因子峰值更早（第2天），随后下降。野生型感染小鼠脑中IL-17A、IL-18、IL-23、IL-28在第1天即显著高于突变株，而IL-27和CXCL10在突变株感染后早期（第1天）即上调。
- **宿主转录组分析**：NanoString神经炎症面板显示，野生型感染后脑部Lcn2、Ccl2等炎症基因上调更显著，Gpr34等基因下调更明显。定向基因集富集分析表明，野生型诱导更强的星形胶质细胞活化、炎症信号和更严重的少突胶质细胞功能抑制。Iba1免疫组化进一步证实野生型感染后小胶质细胞活化程度更高。

**讨论与结论**
讨论部分指出，bimA_Bm替换为bimA_Bp导致细菌在多种细胞类型中复制/存活降低、小鼠LD50升高、生物膜产生减少、组织播散模式改变，特别是脑部播散减弱。组织病理学和IHC结果支持bimA_Bm等位基因促进神经侵袭和脑组织破坏。细胞因子和转录组数据表明，野生型菌株诱导更强的前炎症状态和神经胶质活化，而bimA_Bp突变株可能触发更早的IL-27和CXCL10表达，后者可能具有神经保护作用。结论部分翻译如下：
这项研究通过构建B. pseudomallei ATS2021菌株的等基因bimA突变株，明确了bimA等位基因可归因的差异。用bimA_Bp替换bimA_Bm表明，bimA_Bp等位基因与在多种细胞类型（包括星形胶质细胞和巨噬细胞）中复制或存活的显著降低、以气溶胶方式递送至C57BL/6小鼠时LD50估计值的显著升高、生物膜产生的改变以及在多个器官（包括脑）中显著不同的细菌播散模式相关，这可能导致整体毒力的降低。这些结果支持bimA_Bm基因产物在吸入后细菌播散中的直接作用。