LPS诱导的小胶质细胞中tRNA衍生物片段的特征分析及其对免疫反应的影响

《Brain Research》：Profiling tRNA-derived fragments in LPS-induced microglia and their influence on immune response

　　

Burak Ibrahim Arioz|Leman Binokay|Huseyin Kocakusak|G?khan Karakülah|Sermin Genc

土耳其伊兹密尔生物医学与基因组中心

摘要

大脑中的常驻免疫细胞——小胶质细胞，会应对免疫反应并维持中枢神经系统的稳态。在神经系统和神经退行性疾病中，小胶质细胞在神经炎症中起着关键作用。小胶质细胞的反应与神经退行性疾病、自身免疫性疾病以及癌症相关，因此需要严格调控。转移RNA衍生的片段（tRFs）是由转移RNA经切割产生的小型非编码调控RNA分子。近期研究表明，tRFs是多种生物过程中基因表达和细胞功能的关键调控因子。了解因LPS暴露而导致小胶质细胞中tRFs的变化，有助于揭示疾病发病机制中与神经炎症相关的过程。

我们利用下一代测序技术，分析了LPS诱导的小胶质细胞三种不同组分（裂解液、外泌体以及无外泌体的上清液）中的tRF谱型。在LPS刺激后，这些组分中共有345种tRFs的表达发生改变，其中13种在三种组分中均有表达差异。对这13种tRFs的基因本体分析表明，它们可能参与小胶质细胞的炎症反应。在持续表达异常的13种tRFs中，基于其在所有三种组分中均存在表达差异，以及先前研究显示该片段与神经炎症相关的结果，我们选择了tDR-1:33-Glu-CTC-1-M2作为初步候选分子进行进一步研究。通过RT-qPCR技术，在LPS诱导的小胶质细胞裂解液中进一步确认了该分子的表达增加。抑制tDR-1:33-Glu-CTC-1-M2的表达可降低小胶质细胞中由LPS引发的细胞因子表达和释放，这表明该候选tRF与该模型中的炎症反应存在关联。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞，在生理和病理过程中都发挥着重要作用（Perry和Teeling，2013）。这些细胞持续监测周围环境，与神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及其他脑细胞相互作用（Basilico等人，2022）。作为中枢神经系统中的吞噬细胞，小胶质细胞会主动巡查脑组织。它们负责吞噬微生物、外来颗粒、死亡的神经元及其他细胞，从而维持中枢神经系统的稳态，保护神经元健康，并参与突触修剪过程（Colonna和Butovsky，2017；Ponomarev等人，2013）。在面对细菌和病毒感染时，以及清除细胞碎片和错误折叠的肽类及蛋白质时，小胶质细胞会表现出促炎表型，表现为分泌更多的细胞因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和IL-6，同时还会出现氧化应激加剧和线粒体功能受损的情况（Sochocka等人，2017；von Bernhardi等人，2015）。若小胶质细胞过度活化，就会引发恶性循环的神经炎症，进而加重神经元损伤，导致阿尔茨海默病、帕金森病等疾病的发生（Colonna和Butovsky，2017；Passamonti等人，2019）。Toll样受体，尤其是TLR2和TLR4，能够识别脂多糖、热杀死的细菌等外周炎症信号，从而在调节小胶质细胞炎症方面发挥关键作用（Hoogland等人，2015；Mizuno，2015；Zhao等人，2021）。除了TLR之外，其他分子如小型非编码RNA也会影响小胶质细胞炎症的调控。

tRFs是由成熟的转移RNA经过多种核酸酶的作用而产生的小型非编码RNA分子（Fu等人，2015）。从细菌到人类，不同生物体内都存在进化上保守的tRFs（Kumar等人，2014）。这些通过成熟转移RNA的精确加工产生的片段在细胞生理活动中起着重要作用，同时也与人类健康和疾病密切相关（Anderson和Ivanov，2014）。根据Angiogenin（ANG）和Dicer等酶的切割位点，tRFs可被分为多种类型，包括5′-tRFs、3′-tRFs、5′-halves、3′-halves、5′U-tRFs、3′U-tRFs以及i-tRFs（Fu等人，2023；Keam和Hutvagner，2015；Pliatsika等人，2016；Weng等人，2022）。tRFs属于一类具有重要生物学功能的新型调控性非编码RNA。它们对翻译过程的调控方式包括：通过取代起始因子来抑制整体蛋白质合成，或增强特定mRNA的翻译（Li等人，2024b；Shao等人，2017；Zhu等人，2021）。在压力或感染等应激条件下，细胞内的内切核酸酶会将转移RNA切割成碎片，而这些碎片又会参与细胞的应激反应，因此tRFs可在此类情况下调控基因表达（Huh等人，2021；Lue等人，2010；Mathew等人，2023；Wu等人，2021）。这些小型RNA片段会影响免疫细胞的活化、细胞因子的产生以及炎症的消退，因此在急性和慢性炎症性疾病中都起着关键作用。tRFs的功能失调与自身免疫性疾病、代谢紊乱以及慢性炎症状态有关，这凸显了它们作为炎症相关疾病生物标志物和治疗靶点的潜力（Dunaeva等人，2024）。此外，tRFs还被发现可作为多种疾病的潜在生物标志物，包括骨关节炎、膀胱癌、结直肠癌、非小细胞肺癌以及骨质疏松症（Deng等人，2022；Zheng等人，2022；Zhou等人，2021）。

在中枢神经系统中，由于需要精准调控基因网络以维持神经元功能，tRFs在神经发育、突触可塑性以及神经保护等方面发挥着多种作用（Ivanov等人，2014；Liu等人，2021；Shi等人，2023）。它们的功能失调与多种神经系统疾病有关，包括阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病，以及抑郁症、精神分裂症等精神疾病（Lue等人，2010；Mathew等人，2023；Wu等人，2021）。了解tRFs影响中枢神经系统功能的机制，有望为解决脑健康和疾病相关的复杂问题开辟新的治疗途径。对tRFs的鉴定和特性研究，也为探索其在不同疾病中的功能作用、诊断潜力以及治疗应用提供了新的方向。

在本研究中，我们利用下一代测序技术分析了经LPS处理的小胶质细胞三种组分——裂解液、无外泌体的上清液以及外泌体——中的转移RNA衍生片段，旨在明确炎症激活过程中不同组分中tRFs的变化情况。随后，我们对其中一种候选分子tDR-1:33-Glu-CTC-1-M2进行了初步的表型评估。本研究旨在为未来关于小胶质细胞炎症中tRFs的机制研究提供一个描述性的框架，并提出相关假设。

章节节选

细胞培养

N9小胶质细胞来源于小鼠大脑，通过过表达v-myc基因实现永生化（Righi等人，1989）。这类细胞具备初级小胶质细胞的特征。为了维持细胞生长，我们使用了含有10%胎牛血清、2?mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素以及100?μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基（均来自美国ThermoScientific公司）。这些细胞每周在75?cm²的培养瓶中传代三次，目前的传代次数为15至18代。

LPS可诱导N9小胶质细胞产生促炎性转录反应

在LPS处理N9小胶质细胞24小时后，我们通过RT-qPCR技术检测了TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。结果显示，LPS处理组中TNF-α的表达量增加了约3.5倍，而IL-1β和IL-6的表达量分别增加了近23倍和26倍（见图1A-C）。这些数据表明，LPS成功诱导了N9小胶质细胞中促炎标志物的表达。

对从N9小胶质细胞中分离得到的外泌体的特性分析

我们进行了相关研究……

讨论

小胶质细胞介导的炎症反应参与了中枢神经系统内的多种生理和病理过程，其活性受到包括非编码RNA在内的多种内源性因素的严格调控（Lue等人，2010）。tRFs属于非编码RNA的一类，它们能在应激条件下调控基因表达，同时在炎症和神经相关领域也展现出越来越重要的作用。在本研究中，我们分析了LPS诱导的小胶质细胞三种组分中的tRF变化情况——裂解液、无外泌体的……

数据可用性声明

本研究的原始数据已包含在论文及补充材料中。如有进一步疑问，可联系通讯作者。

伦理声明

伦理审批

本研究是按照《赫尔辛基宣言》的原则开展的。研究已获得伊兹密尔生物医学与基因组中心伦理委员会的批准，批准号为2021-036。

未引用参考文献

Pamies等人，2021年。

CRediT作者贡献说明

Burak Ibrahim Arioz：撰写原文初稿、可视化分析、验证研究结果、项目监督、资源协调、项目管理、方法设计、实验开展、正式数据分析、数据整理、概念构建。Leman Binokay：可视化分析、验证研究结果、软件使用、方法设计、正式数据分析、数据整理。Huseyin Kocakusak：撰写原文初稿、可视化分析、软件使用、方法设计、实验开展、正式数据分析、数据整理、概念构建。G?khan Karakülah：项目监督、方法设计……

资金支持

本研究得到了土耳其科学技术研究委员会的资助（项目编号：122Z019）。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

我们感谢欧洲分子生物学实验室的基因组学核心设施为我们的研究提供了小型RNA测序服务。