iPSCs的自动化扩增技术可实现具有抗衰老生物活性的细胞外囊泡的大规模生产

《Cytotherapy》：Automated expansion of iPSCs enables scalable extracellular vesicle production with anti-senescence bioactivity

　　

南原敏彦|塔米·M·帕森斯|安娜-卡罗琳·劳兰|安吉丽卡·高纳|巴斯卡尔·罗伊|金木隆久

美国佛罗里达州杰克逊维尔市梅奥诊所神经科学系，邮编32224

摘要

背景

:基于诱导多能干细胞（iPSC）的疗法正在快速发展，这需要可扩展且标准化的细胞制造策略。我们建立了一种用于扩增iPSC及其衍生的间充质基质细胞（iMSCs）的自动化工作流程。同时，我们评估了由iPSC和iMSC产生的外泌体（EV）的生物活性。

方法

:通过iACE2自动培养系统扩增iPSC和iMSC。利用切向流过滤法从培养基中分离出EV，并检测其生物活性，包括免疫调节作用及抗衰老效果。

结果

:在自动培养系统和传统手工培养系统中，从培养基中分离出的iPSC和iMSC来源的EV产量相当。通过纳米粒子追踪分析、透射电子显微镜观察以及EV表面标记物检测，发现两种培养系统产生的EV在物理化学性质和生物活性方面并无明显差异。在辐射诱导的成纤维细胞衰老模型中，iPSC来源的EV能够抑制衰老标志物CDKN2A/p16^INK4A的表达，减少衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例，使升高的线粒体呼吸率恢复到正常水平，并降低线粒体中的活性氧含量。此外，我们还发现iMSC来源的EV能够提升成纤维细胞的线粒体呼吸率。

结论

:通过iACE2实现的自动培养系统不仅能够高效扩增iPSC和iMSC以生产EV，还能保持EV的生物活性，优于传统手工操作。这种自动化扩增方法为未来标准化生产具有治疗价值的EV奠定了基础，有助于推动相关技术向临床应用转化。

引言

由于具有无限自我更新能力和多能性，诱导多能干细胞（iPSC）技术已成为再生医学和疾病建模领域的有力工具[1,2]。这些特性使得iPSC成为细胞疗法、药物研发以及生产生物活性细胞制品的理想来源。事实上，由iPSC衍生的间充质基质细胞（iMSCs）因其兼具iPSC平台的可扩展性与间充质基质细胞在再生医学和免疫调节领域中的治疗功效，而被视为极具临床价值的衍生细胞[3]。随着人们对iMSCs临床应用的兴趣日益增加，也就更需要标准化且可扩展的培养流程，以确保在不损害细胞表型或功能的前提下培养出高质量的iPSC及其衍生细胞。iPSC相关技术的临床应用和产业转化，依赖于能否以可重复且可扩展的方式培养高质量细胞群[4]。

对于治疗应用而言，往往需要大量细胞，而传统手工培养难以满足这一需求。此外，要实现临床应用，还需采用符合良好生产规范（GMP）要求的标准化生产流程和质量控制措施，包括使用GMP级材料[5]。手工操作不仅耗时，还会因操作者差异导致结果不一致，进而影响批次间的稳定性及最终产品质量。因此，自动细胞培养系统逐渐受到重视，它不仅能支持大规模培养，还能减少操作者带来的变量影响[6]。不过，在将细胞用于后续治疗生产时，尤其需要确保自动化流程能否与传统手工方法一样保持iPSC的质量和功能潜力。

外泌体（EVs）作为一种极具潜力的无细胞治疗手段，近年来受到了广泛关注[7,8]。EVs是带有生物活性物质的纳米级膜结合颗粒，其中包含蛋白质、脂质和核酸等成分，可介导细胞间通讯。尽管体细胞来源的MSC衍生的EV已显示出一定的治疗潜力，但由于供体间差异、扩增能力有限、传代过程中性质变化以及批次间不一致性等问题，其临床应用面临诸多挑战[9,10]。相比之下，iPSC及其衍生的MSC则属于可再生且更易标准化的细胞来源，有望解决上述生产难题[3,11]。iPSC和iMSC衍生的EV尤为值得关注，因为它们既能保留母细胞的多种生物学优势，又具备便于临床应用的优点，比如无需处理活细胞，且在储存、操作和质量控制方面更具灵活性[7,8]。然而，要将基于EV的产品推向临床，仍需确保其质量的一致性，以及具备与疗效相关的标准化质量指标[8]。

在本研究中，我们旨在通过自动化培养流程扩增iPSC和iMSC并生产EV，同时分析其产量、物理化学特性，以及在功能试验中的生物活性，进而比较其与手工培养所得产品的差异。我们的研究结果表明，自动化系统可作为标准化方法，用于从iPSC及其衍生细胞中生产具有治疗价值的EV，从而为后续的可重复性研究和临床应用奠定基础。

内容节选

材料与方法

iPSC的制备与维持：人类iPSC系MC0039（来自健康男性供体）的制备方法如前文所述，该细胞系已由我们团队进行过特征分析[12]，最初在涂有Matrigel（美国纽约州康宁公司，产品编号354277）的培养皿中，使用TeSR-E7完全培养基（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市STEMCELL Technologies公司，产品编号05914）进行培养。该iPSC系的特征已得到明确验证，其多能性可通过Nanog、TRA-1-60和SSEA4蛋白的免疫染色来确认，此外该细胞系还能在体外分化为三种胚层细胞

用于iPSC和iMSC大规模培养及从培养基中分离EV的自动系统

为建立可扩展的EV生产流程，我们使用了日立公司的自动细胞培养系统（iACE2）来扩增iPSC和iMSC（见图1A–C）。为了与自动培养过程进行直接对比，我们还使用相同的培养容器和接种密度进行了手工培养，以此最大程度减少因容器差异带来的影响。初始阶段，iPSC和iMSC在T75培养瓶中培养，之后再转移到iACE2系统中进行大规模扩增。在自动化工作流程中，

讨论

在本研究中，我们建立了用于标准化扩增iPSC和iMSC的自动培养流程。通过iACE2系统，这两种细胞类型均采用标准化的自动培养流程进行扩增，同时我们还进行了相同条件下的手工培养，通过对比两种方法的培养结果，最大限度地减少了因培养容器差异带来的影响。这样的设计使我们能够直接判断自动化操作是否能够保持与细胞功能相关的关键指标