《PLOS Biology》：The microglia-derived protein sema4ab attenuates regenerative neurogenesis after spinal cord injury in zebrafish
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摘要：与哺乳动物不同，斑马鱼在脊髓损伤（SCI）后可再生神经元，但该过程的调控机制尚不清楚。研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）及体内实验发现，主要由损伤反应性小胶质细胞表达的sema4ab通过改变复杂的损伤微环境减弱再生性神经发生。脊髓损伤后，
摘要：与哺乳动物不同，斑马鱼在脊髓损伤（SCI）后可再生神经元，但该过程的调控机制尚不清楚。研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）及体内实验发现，主要由损伤反应性小胶质细胞表达的sema4ab通过改变复杂的损伤微环境减弱再生性神经发生。脊髓损伤后，敲除sema4ab使新生成的祖细胞和神经元数量翻倍，但抑制轴突再生生长和游泳功能恢复。选择性表达于神经祖细胞的受体plxnb1a/b被敲除同样增加再生性神经发生。此外，敲除sema4ab改变小胶质细胞的活化状态和细胞因子表达，使成纤维细胞上调促再生性神经发生因子tgfb3的表达。因此，研究人员提出小胶质细胞中的Sema4Ab通过直接与Plxnb1a/b受体作用、以及通过调控炎症微环境和tgfb3水平间接抑制再生性神经发生。靶向非再生脊椎动物的Sema4A依赖性信号可能是未来改善再生结局的策略。
论文解读：《The microglia-derived protein sema4ab attenuates regenerative neurogenesis after spinal cord injury in zebrafish》
一、研究背景与立题依据
哺乳动物（包括人类）脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后，由于抑制性微环境及缺乏促再生信号，内源性脊髓祖细胞无法有效产生新神经元，导致永久性功能障碍。与之相反，成年及幼虫斑马鱼具有强大的脊髓再生能力，损伤可诱导脑室区ependymo-radial glial cells（ERGs，兼具室管膜和星形胶质细胞特征的神经祖细胞）增殖并分化为新神经元（再生性神经发生，regenerative neurogenesis）。然而，调控这一再生过程的正负信号尚未完全阐明，尤其对负向调控因子及小胶质细胞（microglia）在损伤微环境中如何协调多种细胞互作知之甚少。小胶质细胞作为中枢神经系统常驻免疫细胞，在损伤后被激活并侵入损伤部位，可通过分泌信号分子影响炎症 milieu、成纤维细胞及神经祖细胞行为。Semaphorin 4A（Sema4A/Sema4Ab）是保守的信号分子，可由免疫细胞表达并调节免疫细胞活化状态，其受体Plexin B1/B2参与发育期神经发生调控，但Sema4A在脊髓损伤再生中的功能未见报道。该研究旨在阐明小胶质细胞源性Sema4Ab是否及如何通过细胞间通讯调控斑马鱼SCI后的再生性神经发生。该论文发表于《PLOS Biology》。
二、主要关键技术方法
研究人员采用3 dpf（days post-fertilization）幼虫斑马鱼全横断脊髓损伤模型；构建sema4ab体细胞突变体（highly-active CrRNAs, haCRs）及种系突变体（germline mutant），plxnb1a/b及tgfb3单/双基因体细胞突变体；使用scRNA-seq（10x Genomics）分析损伤部位（24 hpl, hours post-lesion）整体细胞转录组并比较sema4ab敲除组与对照组；通过杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）及转基因报告线（如her4.1:EGFP标记ERGs, mpeg1:mCherry/4C4标记小胶质细胞与BDMs, mnx1:GFP标记运动神经元, pdgfrb:GFP标记成纤维细胞等）进行细胞类型与基因共定位；EdU脉冲标记检测祖细胞增殖与新生成熟神经元数量；qRT-PCR定量炎症因子及tgfb3表达；免疫荧光标记乙酰化微管蛋白（acetylated tubulin）评估轴突桥接厚度；振动刺激游泳距离测定评估功能恢复；用CellChat分析细胞-细胞互作，用csf1ra/b双突变体进行小胶质细胞特异性耗竭验证。
三、研究结果
sema4ab-dependent microglia signaling indicated by scRNA-seq（scRNA-seq提示sema4ab依赖的小胶质细胞信号）
对损伤后24 hpl损伤旁区组织进行scRNA-seq，鉴定出44个细胞簇。sema4ab高选择性表达于apoeb+小胶质细胞簇（MM#1、MM#2），其受体plxnb1a和plxnb1b富集于her4.1+ ERGs。sema4ab敲除后ERGs中G2/M期细胞比例升高（16%→28%），神经分化标志物（neurog1、neurod1、ascl1a、mnx1）表达上调，CellChat预测sema4ab–Plxnb1a/b配体-受体互作减弱，提示小胶质细胞可直接信号传导至ERGs，且sema4ab缺失促进ERG增殖与分化倾向。
Expression of sema4ab and plexinb1 receptors in vivo（sema4ab及plexinb1受体的体内表达验证）
HCR-FISH显示sema4ab在损伤后6 hpl于损伤位点诱导表达，68.8%为apoeb+/mpeg1:mCherry+小胶质细胞，18%为BDMs，其余部分为中性粒细胞（mpx:GFP+）。plxnb1a和plxnb1b选择性共表达于her4.1:EGFP+ ERGs，BDMs/小胶质细胞中无表达，验证了scRNA-seq的细胞类型特异性。
sema4ab disruption increases regenerative neurogenesis（敲除sema4ab增强再生性神经发生）
体细胞及种系sema4ab突变体中，损伤诱导的新生成熟运动神经元（EdU+/mnx1:GFP+）较对照组增加约85%–95%；ERG增殖（her4.1:EGFP+/EdU+）翻倍；神经前体细胞neurod1+数量增加50%。在未损伤幼虫中sema4ab敲除不影响基础发育性神经发生。在sema4ab种系突变体中热休克过表达sema4ab可回救新生神经元数量至野生型水平，证实sema4ab是再生性神经发生的负调控因子。
sema4ab disruption impairs recovery of swimming function and axon regrowth（敲除sema4ab损害游泳功能恢复和轴突再生）
未损伤sema4ab突变体游泳距离与野生型无差异，但损伤后48 hpl突变体游泳距离较野生型减少35%；轴突桥接厚度较野生型减少25%，表明sema4ab对轴突再生及功能恢复是必需的。
Disruption of plxnb1a/b augments regenerative neurogenesis（敲除plxnb1a/b增强再生性神经发生）
单独敲除plxnb1a或plxnb1b无显著效应，双敲除使新生成运动神经元增加55%，但ERG EdU+标记较sema4ab敲除组减少（表现为ERG增殖未增加），提示sema4ab部分通过Plxnb1a/b直接作用于ERGs抑制神经元分化，但不完全解释sema4ab敲除后ERG增殖增加的现象。
Disruption of sema4ab reduces the number of microglia but does not change numbers of other invading cell types（敲除sema4ab减少小胶质细胞数量但不影响其他浸润细胞）
sema4ab敲除后损伤位点小胶质细胞（4C4+）数量减少约25%，增殖中小胶质细胞减少33%，BDMs数量不变；中性粒细胞及成纤维细胞密度无变化；凋亡碎片清除（acridine orange标记）无差异，提示sema4ab促进小胶质细胞自身增殖/维持。
Cytokine signaling is altered in sema4ab-deficient animals（sema4ab缺陷动物中细胞因子信号改变）
qRT-PCR显示4 hpl各细胞因子无变化，24 hpl时小胶质细胞来源促炎因子il1b（↓50%）、tnfa（↓75%）、il6（↓65%）、il11b（↓45%）及saa（↓75%）显著下调；抗炎因子tgfb1a轻微下调，而成纤维细胞来源tgfb3上调约2.24倍。plxnb1a/b双敲除不改变这些细胞因子水平，说明炎症微环境改变是sema4ab对小胶质细胞的作用而非通过Plxnb1a/b–ERG轴。
Fibroblasts increase tgfb3 expression in the absence of sema4ab function in immune cells（免疫细胞sema4ab功能缺失时成纤维细胞上调tgfb3表达）
HCR-FISH确认tgfb3主要表达于pdgfrb+成纤维细胞而非mfap4+免疫细胞/小胶质细胞；sema4ab主要表达于mfap4+细胞而非成纤维细胞。csf1ra/b双突变体（小胶质细胞耗竭）同样引起tgfb3上调，证明小胶质细胞（通过sema4ab）负向调控成纤维细胞tgfb3表达。IL-1β及TNF信号抑制不影响tgfb3水平，具体受体机制未明。
tgfb3 is enriched in specific fibroblasts clusters and in close contact with ERGs and growing axons（tgfb3富集于特定成纤维细胞亚群并与ERGs及生长中轴突紧密接触）
scRNA-seq中亚群FB#2（间质成纤维细胞）、FB#5（信号相关成纤维细胞1）、FB#6（免疫相关成纤维细胞）及肌成纤维细胞富集tgfb3。组织学显示tgfb3+成纤维细胞分布于损伤区及脊髓残端旁ERGs附近，与生长中轴突及ERGs紧密相邻，具备旁分泌作用条件。
Fibroblasts promote regenerative neurogenesis via tgfb3（成纤维细胞通过tgfb3促进再生性神经发生）
tgfb3体细胞敲除或TGF-β受体抑制剂SB431542处理使损伤诱导新生成运动神经元减少45%，ERG EdU+标记减少35%，证实成纤维细胞源性Tgfb3促进ERG增殖与再生性神经发生。sema4ab与tgfb3双敲除使新生神经元数恢复至对照组水平，表明sema4ab对再生性神经发生的抑制部分通过下调tgfb3实现。
Disruption of tgfb3 abolishes the effect of sema4ab disruption on lesion-induced neurogenesis（敲除tgfb3消除sema4ab敲除对损伤诱导神经发生的影响）
共敲除sema4ab与tgfb3后，新生运动神经元数与对照无差异，证明tgfb3是sema4ab下游介导抑制效应的关键因子。
Potential sema4ab signaling in adult zebrafish and mouse spinal cord injury（sema4ab信号在成年斑马鱼及小鼠SCI中的潜在保守性）
重分析已发表成年斑马鱼及小鼠SCI scRNA-seq数据：斑马鱼成体ERGs表达plxnb1a/b，小胶质细胞（p2ry12+）表达sema4ab，成纤维细胞（pdgfrb+）表达tgfb3；小鼠成体脊髓损伤中小胶质细胞（P2ry12+）表达Sema4A，室管区祖细胞（Foxj1+）表达Plxnb1，成纤维细胞（Pdgfra+）表达Tgfb3，细胞类型特异性保守。
四、讨论与结论总结
研究发现sema4ab主要由损伤反应性小胶质细胞表达，通过两条途径抑制再生性神经发生：（1）直接通过ERGs表面Plxnb1a/b受体抑制神经元分化；（2）间接通过维持小胶质细胞活化状态及促炎细胞因子环境，抑制成纤维细胞产生促再生因子Tgfb3，从而限制ERG增殖。sema4ab同时促进小胶质细胞自身增殖。敲除sema4ab解除抑制使再生性神经发生过度增强，但轴突再生与功能恢复受损，提示再生中各过程（神经发生、轴突生长、炎症消退）需受Sema4Ab等因子精细平衡。Sema4A–Plxnb1–Tgfb3轴在小鼠SCI中也呈现相同细胞类型表达模式，提示其进化保守性，靶向Sema4A信号或为增强非再生哺乳动物脊髓再生提供新策略。
结论（原文翻译）： 研究人员提出损伤后小胶质细胞源性Sema4Ab通过ERGs上的Plxnb1a/b直接信号及通过调控成纤维细胞源性Tgfb3间接抑制损伤诱导的神经发生，从而控制再生性神经发生。小胶质细胞活化状态对脊髓损伤结局至关重要，多种细胞来源促/抗再生信号的平衡决定再生结果。sema4ab主要为微胶质细胞表达，是调控细胞因子milieu及抑制神经元和轴突再生的潜在进化保守信号，Sema4a可能成为非再生哺乳动物治疗靶点。
