生命科学学院李毓龙实验室开发国际首个基因编码的红色乙酰胆碱探针，实现多递质同步活体成像

　　

乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）是人类发现的第一种神经递质，在中枢神经系统与外周神经系统中均扮演关键角色。它广泛参与注意力调控、运动控制、学习记忆、睡眠–觉醒周期，并与动机、奖赏、决策和情绪等核心行为密切相关。近年来，绿色荧光的ACh探针（如GRAB_ACh2.0、GRAB_ACh3.0 和iAChSnFR）已被报道并广泛应用，让研究者得以实时“看见”ACh的动态变化。然而，越来越多的证据表明，ACh作为大脑神经调控网络的重要成员，在发挥作用时往往伴随多巴胺（DA）、五羟色胺（5-HT）等其他神经递质的协同释放与交互调控。要精准解析ACh与其他神经化学分子之间的调控动态和相互关系，亟需多色探针以实现多种神经化学信号的同步检测。遗憾的是，现有ACh探针均基于绿色荧光蛋白开发，而目前广泛使用的DA、5-HT、去甲肾上腺素（NE）及钙离子探针，也大多位于绿色光谱区间。这意味着，长期以来，研究者难以在同一动物、同一脑区、同一时间点，同步记录ACh与其他神经化学分子的动态变化，极大限制了对“多递质协同调控行为”这一关键科学问题的探索。

2026年6月16日，北京大学生命科学学院、生命科学联合中心李毓龙教授团队联合首都医科大学附属北京朝阳医院魏昌伟教授团队，在《自然-神经科学》（Nature Neuroscience）在线发表题为“Red-shifted GRAB acetylcholine sensors for multiplex imaging in vivo”的研究论文。研究团队成功开发国际首个基因编码的红色乙酰胆碱探针，实现了ACh与DA、5-HT及NE等多种信号在多个空间尺度下的同步双通道活体记录与成像，为解析脑内多种神经调质系统之间的协同作用提供了重要研究工具。

李毓龙团队基于自主研发的GRAB（GPCR-Activation Based Sensor）探针策略，巧妙地将人源和鼠源M型ACh受体（M3R）融合成嵌合体骨架，并在其第三胞内环（ICL3）中插入循环重排的红色荧光蛋白（cpmApple）。经过对插入位点、受体骨架与荧光模块的突变筛选与系统优化，成功构建出高亲和力的红色ACh探针，命名为rACh1h。在光学特性方面，rACh1h探针单光子激发峰值为565nm，双光子激发峰值为1050nm 与常用的绿色探针有很好的光谱区分度。体外细胞培养体系中，rACh1h探针展现出良好的膜定位效率，对100μMACh的响应是gACh3.0探针的5倍，表观亲和力为400nM。rACh1h的荧光信噪比和亲和力均超过了现有的绿色ACh探针，为活体水平上同时观测多种神经递质的动态变化，提供了高性能的检测工具。

rACh1h探针的开发

为检验rACh1h能否报告活体动物中内源ACh的释放，研究团队结合光遗传学技术，在小鼠脑内成功记录到内源性ACh的释放动态，并利用药理学手段进一步验证了信号的特异性。得益于探针优异的性能，研究人员不仅能够检测诱发的ACh释放，还能够灵敏且稳定报告小鼠自由活动状态下产生的自发胆碱能活动。

rACh1h检测内源ACh的释放动态

rACh1h探针最重要的突破在于实现了ACh与其他神经递质的同步观测。研究团队将红色rACh1h与绿色多巴胺探针gDA3h共同表达于小鼠BLA脑区，在奖赏学习过程中同步记录ACh和DA的释放动态。实验结果显示，两种神经递质均随着学习进程发生了改变，从最初主要响应实际糖水奖励，逐渐转变为对编码奖励的声音产生反应。研究团队进一步将rACh1h与g5-HT3.0探针联合应用于睡眠-觉醒实验，实现了对ACh和5-HT的长时程同步记录。结果发现，两种神经递质在清醒状态和非快速眼动睡眠阶段呈现相似变化趋势，而在快速眼动睡眠阶段则出现相反的变化趋势：ACh水平升高，而5-HT水平下降。这一发现揭示了不同神经调质系统在睡眠状态转换过程中可能承担不同功能，也展示了双色记录技术在大脑复杂状态研究中的独特优势。

rACh1h在光纤记录系统中实现与其他神经递质的同步观测

rACh1h在光纤实验中已展现出高灵敏度、高时间分辨率和良好的双色兼容性，在成像系统中应用时，其更进一步展现了对ACh动态变化的高时空分辨检测的能力。将rACh1h和NE2m探针共同表达在小鼠背部皮层，结合大视场成像显微镜，可以实现背部皮层多个脑区的ACh和NE释放动态的实时监测。在声音刺激的范式中，给小鼠分别播放野猫叫声、小鼠交配或小鼠刺痛时叫声的录音，rACh1h和NE2m在皮层各个脑区展现出不同的区域分布和动态变化特征，可靠报告了小鼠大脑皮层在处理声音信息时，ACh和NE两种神经递质的释放动态。

rACh1h与绿色NE2m探针共同成像揭示皮层神经递质的动态变化

综上所述，李毓龙实验室拓宽了ACh探针的光谱，成功开发出国际首个基因编码的红色乙酰胆碱探针，能够实现高灵敏度、高特异性、高时空分辨的活体ACh动态检测。红色ACh探针能够与其他绿色探针联合使用，同时报告两种神经化学分子的动态变化，助力实验者解析复杂行为背后多种神经递质相互调控的神经机制。

李毓龙和魏昌伟为共同通讯作者。北京大学生命科学学院博士后谢书、首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉手术中心苗晓蕾博士和北京大学成都前沿交叉生物技术研究院李国川为该论文的共同第一作者。李毓龙课题组郑宇博士、李梦尧博士、纪恩博士、李少创、蔡儒仪博士、耿岚、冯杰思博士，以及首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉手术中心王金旭博士对文章作出了重要贡献。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、生命医学峰基金、新基石科学基金会等多项经费的资助和大力支持。