《Blood Science》：Transcriptomics-based multi-omics approach for optimizing risk stratification in acute myeloid leukemia
编辑推荐：
摘要：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种累及血液及骨髓髓系细胞的造血系统肿瘤。AML的分子分型有助于深入了解疾病发病机制，促进临床诊断与治疗管理。目前分子筛查主要基于DNA水平方法，包括靶向基因panel测序及聚合酶
摘要：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种累及血液及骨髓髓系细胞的造血系统肿瘤。AML的分子分型有助于深入了解疾病发病机制，促进临床诊断与治疗管理。目前分子筛查主要基于DNA水平方法，包括靶向基因panel测序及聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测融合基因，而基于转录组的RNA测序（RNA-seq）因可改善分子分型、辅助预后预测及治疗选择而日益受到关注。研究人员旨在排除携带PML::RARA融合基因的AML患者队列（n=125）中鉴定与分子基因分型和风险分层相关的转录组特征，并建立基于转录本表达量的两步法诊断评估方法，以更高置信度和准确度预测AML患者结局。将遗传突变及融合基因鉴定结果与转录组分层相结合，可显著增强结局预测能力。总之，研究人员开发了一种基于转录组学的多组学预测模型，用于改善AML患者的风险分层。
论文解读——《Blood Science》刊载研究
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）具有高度异质性，2022年世界卫生组织（World Health Organization, WHO）第5版分类及欧洲白血病网（European Leukemia Net, ELN）风险分级虽强调遗传学异常，但仍难以完全区分不同遗传亚组中治疗结局存在差异的患者。现行精准诊疗主要依赖细胞遗传学及DNA水平靶向二代测序（next-generation sequencing, NGS），但基因组变异未必在转录水平体现，且转录本作为功能产物与疾病表型及临床关联更密切。已有研究表明RNA-seq可同时检测突变、融合基因及全转录组表达谱，有望弥补DNA检测的不足。因此研究人员开展此项研究，在125例非PML::RARA阳性（非M3型）初诊AML患者中进行DNA靶向测序、反转录定量PCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）融合基因检测及RNA-seq，探索转录组特征对分子分型和风险分层的补充价值，建立基于转录组表达的多组学预测模型，以期提高AML预后预测准确性及治疗指导能力。
主要关键技术方法
研究人员纳入2021年2月至2022年10月陆军军医大学新桥医院125例初诊非M3型AML患者（排除PML::RARA阳性），采集骨髓或外周血共提取基因组DNA（genomic DNA, gDNA）和总RNA。①DNA靶向NGS：分别使用38基因扩增子panel（Rightongene）和129基因液相杂交捕获panel（Shenyou Bio）进行测序，比对GRCh37参考基因组，用VarDict检测单核苷酸变异（single-nucleotide variants, SNVs）及插入/缺失（indels）。②RT-qPCR：使用多重RT-PCR融合基因试剂盒检测43种融合基因。③转录组测序（RNA-seq）：rRNA去除建库，DNBSEQ-T7平台测序，比对hg38参考基因组，用StringTie计算基因表达量，以GTEx数据库30例正常人样本为对照。④无监督层次聚类：对AML与正常对照间差异表达基因（p<0.05且|log2FoldChange|>1）进行聚类，划分表达亚型。⑤功能富集分析：采用DAVID进行基因本体论（Gene Ontology, GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析。⑥风险分层回归模型：采用Cox多因素回归筛选预后相关变量，Lasso回归降维优化，受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线评估模型效能。
3.1. Genetic clustering based on transcriptomic sequencing in PML-RARA-neg AML patients（PML-RARA阴性AML患者基于转录组测序的基因表达聚类）
研究人员从125例患者与30例正常对照中筛选出6303个差异表达基因（p<0.05且倍数变化≥2倍），对其进行无监督层次聚类将患者分为C1–C8共8个簇。87例有随访资料的患者中，不同簇的无进展生存期（progression-free survival, PFS）存在显著差异，左侧簇生存较差、右侧簇较好；该RNA分型与预后的关联优于2022版WHO分类。
3.2. Transcriptome-based risk stratification（基于转录组的风险分层）
将C1–C8合并为3个超簇（supercluster, SC）：SC1（C1–C2）、SC2（C3–C5）、SC3（C6–C8），三组间PFS差异有统计学意义（p=0.034），SC1差于SC3（p=0.020）。进一步提取SC间921个差异表达基因重新分类为改进超簇（improved supercluster, iSC）iSC1–iSC3，iSC间预后差异更显著（p=0.010），iSC1差于iSC2和iSC3（p=0.032和0.023）。将iSC1定为预后组1（prognostic group 1, PG1），iSC2+iSC3定为PG2，两组PFS差异极显著（p<0.001）。
3.3. Molecular pathways characterization by GO and KEGG enrichment analysis（GO与KEGG富集分析表征分子通路）
对921个特征基因行GO及KEGG富集，显著条目包括G蛋白偶联受体信号通路（G-protein-coupled receptor signaling pathway, GPCRs）、嗅觉受体活性（olfactory receptor activity, ORs）、DNA结合、RNA聚合酶II相关转录、细胞分化、cAMP信号通路及适应性免疫应答等。PG1与PG2间上述功能基因集的表达模式差异显著（p<0.001）。
3.4. Characteristics of genetic mutations and fusion genes in PML-RARA-neg AML patients（PML-RARA阴性AML患者基因突变及融合基因特征）
87例有随访患者中每例平均检出8.08个突变，高频突变基因为TTN（61%）、MUC16（29%）、NRAS（25%）、DNMT3A（21%）、CEBPA（18%）、FLT3-ITD（18%）、NPM1（17%）等。27.6%（24/87）患者至少携带1种融合基因，常见为CBFB::MYH11（11.5%）和RUNX1::RUNX1T1（6.9%）。多数突变基因在突变型与野生型间表达量无显著差异；仅NPM1及TTN突变与更好PFS相关（p=0.019和0.027）。
3.5. Transcriptome-based prediction model（基于转录组的预测模型）
基于921基因经筛选和多变量Cox及Lasso回归，确定10个关键基因构建公式A（评分y=各基因表达z-score×系数+常数），以截断值?0.042区分PG1与PG2，ROC曲线下面积（area under the curve, AUC）=1，特异度与敏感度均100%。对PG1内55例患者再建公式B（6个基因），截断值?0.711时特异度91.4%、敏感度70.0%，并结合DNMT3A、GATA2等高突变基因辅助PG1内部预后判断。最终形成"先分PG1/PG2，再细分PG1内复发/缓解"的两步预测模型。
讨论与结论
目前AML诊断与危险度评估主要依赖细胞遗传学及DNA水平靶向测序，但遗传变异不一定反映到转录水平——而转录组是基因功能的直接体现，与疾病临床表型关联更紧密。既往研究显示RNA-seq可同时检出SNV、indel、融合基因及表达谱，是多组学整合分型的有力工具。本研究采用无监督层次聚类（Canberra距离）而非一致性聚类，所得8个转录簇未如既往大样本研究呈现清晰融合基因对应亚型，但显示出强预后相关性，印证了转录水平异常对疾病判别的重要性。GO富集发现GPCR及嗅觉受体通路在AML中显著失调，后者已在多癌种中被报道具诊断及药物开发潜力。本研究局限性包单中心、样本量偏小、缺乏独立外部队列验证、模型主要基于转录组数据且未深入解析特征基因通路的具体机制。综上，研究人员证实RNA-seq在AML分子分型与预后预测中具有独立价值，所建立的基于转录组学的多组学预测模型可有效改善非M3型AML患者的风险分层与结局预测，并为今后探讨嗅觉受体通路在AML中的作用及靶点发现提供线索。
