来自Teredinibacter haidensis和Cellvibrio japonicus的新型纤维二糖2-差向异构酶的表征

《BMC Biotechnology》：Characterization of novel cellobiose 2-epimerases from Teredinibacter Haidensis and Cellvibrio Japonicus

　　

摘要背景：纤维二糖2-差向异构酶（CEs）是一类具有应用前景的酶，能够催化乳糖转化为具有生物活性的二糖——表乳糖和乳果糖。在乳制品应用中，低温（≤8 °C）乳糖生物转化对于防止微生物污染至关重要。然而，大多数CEs在这类低温条件下活性并不理想。因此，本研究旨在发掘并表征新型低温活性CEs。

结果：研究人员表征了两种来源于Teredinibacter haidensis的新的中温型（mesophilic）CE（ThCE）和来源于Cellvibrio japonicus的新的中温型CE（CjCE），二者除具有差向异构化（epimerization）活性外，在低温下还表现出异构化（isomerization）活性。ThCE在pH 7.5和35 °C时表现出最高差向异构化活性，为595.4?±?4.4 nkat/mg protein；CjCE在pH 9.5和40 °C时达到最高差向异构化活性，为887.4?±?3.9 nkat/mg protein。此外，CjCE在较宽的pH范围（6–9.5）和温度范围（30–45 °C）内均保持>80%的活性。两种CE在8 °C下均表现出显著活性和稳定性。具体而言，ThCE和CjCE在8 °C时分别保留约20%和40%的差向异构化活性，半衰期分别为96.3 d和72.2 d。此外，还发现CjCE能够在8 °C下催化异构化反应。在乳糖浓度提高至600 mM时，ThCE和CjCE的异构化活性分别提高约370倍〔70.8?±?2.7 nkat/mg protein，ThCE为35 °C〕和约230倍〔66.1?±?0.3 nkat/mg protein，CjCE为40 °C〕。这一结果表明，在研究CEs催化乳糖异构化生成乳果糖时，有必要将乳糖浓度考察至其溶解度极限。

结论：本研究鉴定出两种新的CE，它们表现出值得关注的催化特性，具有在低温条件下由乳糖生成具益生元特性的二糖的潜在应用价值。

该论文发表于《BMC Biotechnology》，围绕低温乳制品加工中乳糖生物转化效率不足这一关键问题展开。纤维二糖2-差向异构酶（cellobiose 2-epimerases, CEs）属于N-乙酰-D-葡糖胺2-差向异构酶（N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase, AGE）超家族，是目前已知唯一能够催化β-1,4连接二糖发生差向异构化的酶类。这类酶能够将乳糖转化为表乳糖和乳果糖，两者均属于具有益生元功能的生物活性二糖，在肠道健康和功能食品开发方面具有较高应用价值。由于乳制品体系在工业上通常处于≤8 °C冷链条件，若酶能够在低温下直接催化乳糖转化，便可同时降低能耗、抑制微生物生长并避免热诱导副反应。然而，既往报道的大多数CEs在低温下活性偏低，往往需要较高加酶量，增加了工艺成本。因此，筛选并表征兼具低温活性与低温稳定性的CEs，成为该领域的重要研究方向。

在这一背景下，研究人员通过序列挖掘、异源表达与酶学表征，发现并系统分析了两种新型CE，分别来源于Teredinibacter haidensis和Cellvibrio japonicus，命名为ThCE和CjCE。研究结果表明，这两种酶虽来源于中温菌，却都具有较好的低温适应性；其中CjCE不仅在低温下保持较高差向异构化活性，还可在8 °C下检测到乳糖异构化生成乳果糖的能力。论文据此指出，这两种新酶，尤其是CjCE，在低温乳糖定向转化和功能性二糖制备方面具有潜在应用前景。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：首先利用PCR筛选结合数据库BLAST比对进行体外序列挖掘，从德国Esslingen与Sonnenbühl采集的葡萄园和洞穴土壤宏基因组DNA中获得CE样开放阅读框（ORFs）；随后将候选基因进行密码子优化、克隆至`pET-20b(+)`载体，并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中异源表达；进一步通过固定化金属亲和层析（IMAC）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、体积排阻色谱（SEC）和高效液相色谱（HPLC）完成蛋白纯化、分子量分析及产物定量；最后通过pH、温度、半衰期、Michaelis常数（K_m）及底物谱分析，对酶的生化性质和催化特征进行了系统评价。

在“Selection of putative CEs and confirmation of the epimerization activity”部分，研究人员以两个CE样ORFs作为模板，在多个蛋白数据库中开展BLAST筛选，并结合微生物来源、生长温度、潜在代谢底物以及与已知CsCE和RaCE的序列相似性，最终筛选出4个候选蛋白，即ThCE、CjCE、PpCE和SaCE。这些候选序列均保留了与RaCE催化残基His184、His243和His374对应的关键位点。经重组表达初筛后，仅ThCE和CjCE在E. coli BL21(DE3)中实现明显过表达，并在粗酶液中检测到对乳糖的差向异构化活性，而PpCE和SaCE未检测到活性。由此确定ThCE和CjCE为后续重点研究对象。

在“Recombinant production of ThCE and CjCE in E. coli”部分，研究人员分别在摇瓶和5 L生物反应器中放大生产ThCE和CjCE。结果显示，两种酶在重组E. coli中均能有效表达，且反应器培养显著提高了产酶水平。ThCE在摇瓶中诱导4 h后达到最高差向异构化活性52.5?±?2.6 μkat/L_culture，CjCE在诱导8 h后达到71.1?±?1.7 μkat/L_culture。在生物反应器中，ThCE和CjCE活性进一步升高，总活性分别达到373.0 μkat和2126.0 μkat，说明两种酶具备进一步制备和应用研究的可行性。

在“Purification of ThCE and CjCE”部分，研究人员利用IMAC从破碎上清中纯化目标蛋白。纯化后ThCE和CjCE的纯化倍数分别为12.1倍和3.0倍，比活分别达到380.9和140.4 nkat/mg protein，活性回收率分别为74.1%和89.0%。SDS-PAGE显示两种蛋白均在约40–50 kDa处出现明显单一条带；SEC测得ThCE和CjCE分子量分别为43.9和41.2 kDa，结合理论分子量分析，说明两种酶均以单体形式存在。这一结构特征与既往报道的多种CE一致。

在“Effect of pH and temperature on the activity of ThCE and CjCE”部分，研究人员系统分析了两种酶的最适反应条件。ThCE最适pH为7.5，而CjCE表现出更宽广的pH适应范围，在pH 6.0–9.5之间均可保持80%以上相对活性，显示出较强的环境耐受性。温度方面，ThCE和CjCE的最适温度分别为35 °C和40 °C。值得注意的是，两种酶在8 °C下仍保持一定活性，ThCE约保留20%，CjCE约保留40%，表明二者虽为中温酶，却具备明确的低温催化能力，其中CjCE低温适应性更强。

在“Temperature stability of ThCE and CjCE”部分，研究人员考察了不同温度下的酶稳定性。结果显示，两种酶在各自最适温度下热稳定性一般，但在较低温度下稳定性显著增强。ThCE在8、25和35 °C下的半衰期分别为96.3、3.5和0.7 d；CjCE在8、30和40 °C下的半衰期分别为72.2、16.0和1.0 d。尤其在8 °C条件下，两种酶均表现出很长的半衰期，说明其适合冷链环境中的持续反应过程。尽管与部分已报道中温CE相比热稳定性并不占优，但其低温稳定性恰好契合乳制品加工需求。

在“Investigation of the epi- and isomerization activity”部分，研究人员同时评估了差向异构化和异构化性能。以150 mM乳糖为底物时，ThCE在35 °C下的差向异构化比活为5.95 × 10²?±?4.4 nkat/mg protein，在8 °C下降至1.07 × 10²?±?1.6 nkat/mg protein；CjCE在40 °C下为8.87 × 10²?±?3.9 nkat/mg protein，在8 °C下为87.8?±?3.9 nkat/mg protein。异构化方面，ThCE仅在35 °C下检测到极低活性，在8 °C下未检测到；CjCE则在40 °C和8 °C下均检测到异构化活性，显示其在低温生成乳果糖方面更具潜力。进一步通过K_m测定发现，ThCE对乳糖的亲和力高于CjCE，前者K_m为247.3 mM，后者为524.0 mM。

该部分更重要的发现是，高底物浓度显著增强了异构化活性。当乳糖浓度由150 mM升高至400和600 mM时，两种酶的异构化活性均大幅上升，在600 mM时ThCE和CjCE分别达到70.8?±?2.7和66.1?±?0.3 nkat/mg protein，增幅分别约为370倍和230倍；相比之下，差向异构化活性仅提高约1.6倍和1.9倍。该结果表明，以往在较低乳糖浓度下对CE异构化能力的评估可能明显低估其潜力，也提示研究乳果糖生成时应尽可能将底物浓度提高至乳糖溶解度极限附近。

在“Investigation of the substrate selectivity of ThCE and CjCE”部分，研究人员比较了两种酶对多种单糖和二糖底物的催化特征。结果表明，ThCE和CjCE均不能催化N-乙酰葡糖胺，这与CE家族已知特性一致；二者均可催化甘露糖与葡萄糖的相互转化，但对果糖无活性。对于二糖，二者均可作用于乳糖、表乳糖、纤维二糖和麦芽糖。以乳糖和表乳糖为底物时，同时检测到差向异构化和异构化产物，且差向异构化产物含量更高，说明差向异构化反应速率快于异构化。以乳果糖为底物时未检测到产物，提示两种酶对乳果糖亲和力较低。总体上，CjCE对葡萄糖、甘露糖以及乳糖、表乳糖的异构化反应表现出较强催化能力，而ThCE在表乳糖向乳糖转化方面表现最强。

论文讨论部分的核心在于：这两种新发现的中温型CE虽然并非来源于嗜冷微生物，但均具备明显的低温活性和低温稳定性，说明通过基因挖掘可以从非嗜冷来源中获得适用于冷链条件的候选酶。CjCE兼具宽pH适应范围、较强低温活性以及8 °C下可检测的异构化能力，是更具应用潜力的候选酶。另一方面，研究还表明，CE催化乳糖异构化生成乳果糖的能力与底物浓度密切相关，在接近乳糖溶解度上限时表现尤为突出，这为今后设计高底物浓度、低温条件下的乳糖生物转化工艺提供了重要依据。总体而言，该研究不仅扩展了CE的酶学资源，也为低温乳制品体系中原位制备表乳糖和乳果糖提供了实验基础。

研究结论部分可译为：编码两种推定CE的基因——分别来源于T. haidensis的ThCE和来源于C. japonicus的CjCE——已被克隆并在E. coli中表达。随后，研究人员对这两种酶进行了纯化与表征。研究表明，两者均为中温酶，但在低温（8 °C）下表现出可观的差向异构化活性。此外，ThCE和CjCE均能够在各自的温度最适条件下催化乳糖异构化反应。尤其值得注意的是，CjCE在8 °C下也表现出可检测的异构化活性，提示其在低温乳制品加工应用中具有进一步研究价值。未来若进一步聚焦于低温条件下牛乳乳糖的酶法转化，将有助于更全面地评估其实际应用潜力。