将软骨细胞水凝胶培养物生物打印至纤维膜上用于软骨缺损修复

《Biomaterials Science》：Bioprinting chondrocyte hydrogel cultures onto fibre membranes for cartilage defect repair

　　

尽管自体软骨细胞植入（autologous chondrocyte implantation, ACI）在过去三十年中取得了显著进展，但细胞分布不均、接种密度低以及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）形成有限等持续性挑战仍在阻碍其临床疗效。本研究提出了一种基质辅助自体软骨细胞植入（matrix-assisted ACI, MACI）的新策略，该策略将活性喷射冲击（reactive jet impingement, ReJI）生物打印技术与Chondro-Gide?（Ch-G）膜相结合，旨在实现手术室环境下的生物打印方法，从而在植入点控制细胞分布与密度。研究人员将胶原-海藻酸-纤维蛋白（collagen–alginate–fibrin, CAF）水凝胶配制成生物墨水，以维持高细胞存活率并实现低、高两种密度软骨细胞的精确沉积。骨髓来源的永生化干细胞经诱导分化为软骨细胞后，利用ReJI系统生物打印至Ch-G底物上。构建体在14天内评估了细胞毒性、形态学、基因表达、细胞外基质沉积及力学性能。活/死染色检测证实所有条件下均具有高细胞存活率。免疫荧光及扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）分析显示细胞排列、表面迁移及细胞外基质形成均得到增强，尤其在Ch-G/CAF高密度组中表现突出。ACAN与SOX9从第1天至第14天显著上调，免疫组化分析证实了Ⅱ型胶原（collagen II, COL II）及硫酸化糖胺聚糖（sulphated glycosaminoglycans, sGAGs）的 robust 沉积。力学测试表明压缩模量随时间延长而增加，Ch-G/CAF构建体表现出更优的刚度及体积稳定性。这些发现提示，将CAF水凝胶通过ReJI生物打印至Ch-G膜上可促进软骨形成活性及基质形成，为下一代MACI提供了有前景的策略。

骨关节炎（osteoarthritis, OA）是全球范围内的重大健康问题，约7.6%的世界人口受其影响，预计到2050年这一比例将增加近一倍。关节软骨损伤是OA疼痛的主要原因，该组织由水、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原及软骨细胞组成，起着承重、吸能及减少关节摩擦的关键作用。由于关节软骨无血管分布，其自我修复能力极为有限，一旦损伤往往导致持续性的功能障碍与生活质量下降。

自体软骨细胞植入（ACI）作为治疗关节软骨损伤的经典方法已逾三十年历史。第一代ACI需从胫骨采集健康软骨，体外分离扩增软骨细胞后，在二次手术中将细胞悬液注入缺损处并覆以骨膜瓣。然而骨膜的使用存在诸多局限，第二代ACI转而采用生物材料支架填充缺损，其中Chondro-Gide?（Ch-G）胶原纤维膜是临床应用最为成功的支架之一，至今仍被广泛使用。后续发展出的基质辅助自体软骨细胞植入（MACI）将软骨细胞与水凝胶基质预先复合，Spherox技术则将软骨细胞组装为球状体，两者均致力于构建有组织的"三维"细胞培养体系，而非简单注射细胞悬液。然而，低接种密度、植入过程中细胞流失及缺损处分布不均等问题仍制约着ACI疗效。值得关注的是，细胞密度过低虽可能影响修复效果，但过高密度亦未必能带来线性改善，因此寻找最佳密度范围具有重要意义。

在此背景下，生物打印技术为组织工程三维细胞培养带来了革命性突破。该技术能够精确控制结构与分辨率，构建在力学性能、结构设计和生理功能方面高度模拟天然组织的三维培养体系，从而实现细胞分布的均一化和密度的最优化。挤压式生物打印是最常用的水凝胶三维细胞培养打印方式，但其在高细胞密度水凝胶制备及可打印底物范围方面存在局限。活性喷射冲击（ReJI）技术克服了这些不足，可实现从较低密度到接近生理水平的多种细胞密度，并能于多种硬质或软质底物上进行打印。该技术利用微阀产生水凝胶前体聚合物溶液与交联剂溶液的液流，液滴在空中相遇反应形成水凝胶液滴后落至底物，若细胞悬浮于任一或两种溶液中则将被包裹于水凝胶液滴内。

本研究提出了一种MACI新策略，即在手术室环境下利用ReJI生物打印制备细胞/水凝胶/纤维膜复合结构用于植入。研究人员选择CAF水凝胶作为生物墨水，因此前研究已证实该系统可支持多种细胞类型及密度的ReJI生物打印，且细胞存活率优异。研究以基质产量作为关键评价指标，比较了有无Ch-G膜、低/高细胞密度条件下的培养效果，评估了细胞毒性、形态学、增殖、基因表达、细胞外基质沉积及力学性能。

研究中永生化人骨髓间充质干细胞（BMSC-hTERT，Y201细胞系）经21天诱导分化为软骨细胞（Y201-C），该细胞系已被证实是评估关节治疗的有效模型。生物打印采用定制化ReJI生物打印机，两个电磁微阀以55°倾角排列，喷嘴直径500 μm，通过峰值保持驱动器控制液滴喷射。打印参数由专用软件调控：矩形波形3.2 V，驻留时间800 μs，频率100 Hz，交联剂喷射压力380 mmHg，预凝胶生物墨水压力400 mmHg。为防止细胞和颗粒沉降，储液槽中采用磁旋转金涂层圆盘进行持续搅拌。CAF水凝胶以96孔板格式打印，每孔67滴（20 μL），分低密度（CAF-L，5×10⁶ cells mL^-1）和高密度（CAF-H，2.5×10⁷ cells mL^-1）两组。Ch-G膜冲压为6 mm直径置于孔内，采用位图技术（10×10像素）增强水凝胶与胶原纤维的整合。力学表征样品采用25像素直径圆形位图打印两层，约8 mm直径、3 mm厚度。对照组为手动接种于Ch-G膜上的细胞（低密度2.5×10⁵ cells cm^-2，高密度1.25×10⁶ cells cm^-2）。

主要技术方法包括：活/死染色评估细胞存活；Alexa Fluor? 555-鬼笔环肽及DAPI染色进行免疫荧光及细胞形态观察；SEM分析细胞形态及细胞外基质形成；RT-qPCR检测ACAN和SOX9基因表达，以GAPDH为内参，采用2^(?ΔΔC_t)法相对定量；免疫组化检测COL II沉积及Alcian Blue/Nuclear Fast Red染色检测sGAG；UniVert力学测试仪进行压缩模量测定（十字头速度0.5 mm min^-1，应变10-15%线性区计算模量）；GraphPad Prism 10进行双因素方差分析及Tukey多重比较检验。

**生物打印过程与细胞存活**：生物打印过程产生了结构一致的构建体。活/死检测显示所有条件和时间点均具有高细胞存活率，对照组在第1天和第3天亦表现出极少的细胞死亡，证实CAF水凝胶及打印过程无显著细胞毒性。

**细胞与培养物形态学**：免疫荧光显示从第7天起软骨细胞开始伸展延长，高密度组中细胞间连接更强；至第14天，CAF-L、CAF-H和Ch-G/CAF-H组形成更致密的细胞聚集体。Ch-G/CAF组中细胞因凝胶在纤维膜上展开而主要呈扁平二维分布。

**细胞外基质形成**：SEM观察显示，第7天时CAF凝胶中细胞多包埋于凝胶内，而Ch-G组细胞开始向表面迁移；至第14天，所有样品均可见细胞迁移及细胞外基质形成，Ch-G组表面迁移加速且支持早期细胞外基质沉积，细胞沿纤维附着生长形成类单层结构。

**软骨形成基因表达**：SOX9表达在无Ch-G组最低，Ch-G-H组第1天显著升高，但至第14天各组整体与第1天水平相近。ACAN表达在所有组别中从第1天至第14天均显著持续增加。接种方式间无显著差异，但Ch-G和Ch-G/CAF组的高、低密度间存在显著差异。

**蛋白质产生**：Ch-G/CAF-H组COL II表达最强（棕色染色密集），对照组中Ch-G-H亦高于Ch-G-L。sGAG表达同样在Ch-G/CAF-H组显著高于其他条件。这表明高密度CAF凝胶生物打印至Ch-G膜上显著增强了COL II和sGAG的分泌。

**压缩模量与体积变化**：14天内除无细胞凝胶外所有组压缩模量均显著增加。第14天基质形成后CAF组差异显著，Ch-G/CAF组趋势类似。Ch-G/CAF样品第14天压缩模量显著升高，且细胞密度间无显著差异。体积分析显示大多数组从第1天至第14天无显著变化，仅Ch-G/CAF-L组体积增加，推测源于细胞增殖，而Ch-G/CAF-H组可能因接触抑制而增殖受限。

**讨论**：高细胞存活率与既往多细胞系研究一致。第7至14天的高密度构建体中细胞排列和网络化良好，Ch-G/CAF组的增强表面迁移和沿胶原纤维定向排列表明纤维膜不仅支持细胞附着，还促进定向迁移与组织化，这对有效组织再生至关重要。细胞填充的CAF水凝胶作为空间固定的软骨细胞储库，可逐渐迁移定植于结构。第14天所有样品均可见厚细胞外基质样层，Ch-G/CAF-H组沉积最多。

ACI的关键局限在于体外扩增中软骨细胞的反分化及细胞外基质调控改变。本研究中ACAN显著上调表明活跃基质合成，SOX9在Ch-G组升高提示该膜促进软骨形成。作为任何ACI类型 procedure 关键的软骨修复结局指标，基质产量在本研究中被重点评估。结果明确显示，结合ReJI生物打印与Ch-G膜的新MACI变体，在体外评估中较单纯打印水凝胶或单纯Ch-G膜接种产生了更多基质沉积。

SOX9和ACAN作为软骨基质形成的关键调控因子，促进COL II和糖胺聚糖（GAGs）合成，因此评估其实际沉积对判断软骨形成分化和ACI疗效至关重要。免疫组化显示Ch-G/CAF-H组强烈的COL II和GAG染色，突出了高细胞密度与底物整合在增强软骨形成活性和基质沉积中的协同作用。构建体尺寸的长期稳定性对临床转化至关重要，可确保再生过程中的稳定缺损覆盖和力学支撑。压缩测试显示所有细胞构建体从第1天至第14天杨氏模量显著增加，Ch-G/CAF组刚度最高，这与细胞外基质积累及细胞重塑相关，提示生物打印构建体正向软骨样力学行为进展。尽管模量仍低于天然软骨（0.3–0.8 MPa），这一趋势支持延长培养后的进一步成熟潜力。Ch-G/CAF组较CAF凝胶保持更高体积，表明结构完整性更佳且基质保留可能增强。

研究人员认为本研究证实，将ReJI生物打印与Ch-G膜结合可为MACI提供增强策略。该过程仍需软骨采集、细胞分离扩增，但软骨细胞可在手术室打印至Ch-G膜上后植入。生物打印的额外临床价值在于可按需分布细胞：均匀分布，或集中于Ch-G膜附近，或朝向骨软骨界面。细胞包封还可减少植入过程中的细胞流失，解决细胞流失和分布不均的公认问题，可能加速缺损修复，但仍需进一步研究证实。展望未来，ACI联合间充质干细胞（MSCs）递送可进一步增强疗效，生物打印有利于实现共培养类型（混合、分层、分区或组合）及两类细胞在缺损体积中的梯度分布。

**结论翻译**：通过ReJI生物打印将高密度细胞负载CAF水凝胶与Ch-G底物整合，为下一代MACI提供了有前景的策略。该方法增强了细胞存活、增殖、细胞外基质产生和力学性能，解决了传统ACI技术的关键局限性。未来工作将推进该策略向体内研究发展。